Contextualización: el café ha sido, por más de un siglo, el principal producto de la economía nacional y, por tanto, el que mayor incidencia ha tenido en el desarrollo socioeconómico de Colombia; es por ello, de gran relevancia, monitorear los factores bióticos y abióticos que inciden en la producción del café, especialmente en el departamento Norte de Santander. La zona cafetera del departamento está comprendida entre los 6º56’42” y 09º18’01” de latitud norte y los 72º01’13” y 73º38’25” de longitud oeste.

Vacío de conocimiento: los escasos estudios relacionados con los contaminantes fúngicos en el café [de la región de Norte de Santander] limitan dilucidar las variables y factores que contribuyen a la proliferación de estos, lo que puede afectar la calidad y aumentar el riesgo de incidencia de micotoxinas en el café de esa región.

Propósito: el objetivo del estudio fue determinar la prevalencia de los hongos aislados en la etapa de procesamiento del café (Coffea arabica L.) tipo cereza, producido en los diferentes municipios de Norte de Santander.

Metodología: Se realizaron muestreos en ocho municipios cafeteros del departamento Norte de Santander. A nivel microbiológico se determinaron las características fenotípicas con ayuda de claves taxonómicas. A nivel genotípico se utilizaron los iniciadores ITS4 e ITS5 del DNA ribosomal fúngico para realizar una búsqueda, mediante la herramienta BLAST, en base de datos curadas para determinar la especie. Se determinaron variables fisicoquímicas [pH, actividad de agua y porcentaje de humedad]. Se realizó un análisis de varianza [ANOVA], se aplicaron las pruebas de comparación múltiple o post-hoc de TUKEY y también un análisis discriminante.

Resultados y conclusiones: A partir del café tipo cereza, cultivado en los municipios cafeteros de Norte de Santander, se aislaron 60 cepas axénicas de mohos filamentosos. De acuerdo con la caracterización fenotípica, los hongos predominantes en los granos de café fueron: Fusarium spp. (35 %), Penicillium spp. (25 %), Geotrichum spp. (22 %) y Aspergillus spp. (15 %). La identificación molecular confirmó la presencia de los géneros Fusarium spp., Penicillium spp., Aspergillus spp., y Geotrichum spp. Se encontró que las variables fisicoquímicas condicionan el crecimiento y proliferación de los hongos en los granos de café; también se determinó que existen diferencias estadísticamente significativas y similitudes entre los municipios muestreados, lo que permitió establecer dos grandes grupos correlacionados entre sí, de acuerdo con las variables fisicoquímicas monitoreadas.

El café [Coffea arabica L.] representa, a nivel mundial, el segundo producto básico de mayor importancia económica. En Colombia, sigue siendo el protagonista de la economía; sin embargo, los granos de café han sido susceptibles a contaminantes fúngicos (Garrido-Ramírez et al., 2018) que afectan la producción, especialmente en el departamento de Norte de Santander. La zona cafetera de Norte de Santander se ubica sobre la vertiente de la Cordillera Oriental, el departamento está comprendido por 40 municipios, de los cuales 36 registran producción cafetera, con un total de 30.670 hectáreas de cultivos de café. El 51 % del área está cultivada con café tradicional, y más del 90 % del total del área cafetera del departamento tiene sombrío.

En el Norte de Santander, la población cafetera está conformada por pequeños productores cuyas fincas tienen un área promedio cultivadas con café de 0.5 a 3.0 hectáreas. La caficultura de la región está ubicada en la zona óptima para café entre los 1 200 m s. n. m. y los 1 800 m s. n. m. (Giraldo-Jaramillo et al., 2020). La precipitación oscila entre 1 579 mm a 2 820 mm al año, con temperaturas que varían entre 14,8 °C y 31,1 °C; con temperatura promedio de 19,6 °C. La zona cafetera presenta en promedio 1,33 meses secos durante el año, encontrándose zonas secas con períodos hasta de 6 meses (Villegas et al., 2015). Estos indicadores bioclimáticos [aunados a los sistemas de producción], las características químicas del grano de café y las propiedades del suelo de cultivo propician el desarrollo de hongos filamentosos. Sin embargo, el café tiene algunas ventajas, en comparación con otros cultivos básicos, como lo afirma la Organización de la Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO, 2017):

Losgranos de café están sujetos a la contaminación por hongos (Cajiao et al.,2016) durante todas las etapas de desarrollo y procesamiento. La variedad dehongos en el fruto de café depende de diversos factores como la variedad delcafé, región geográfica, clima, y los métodos de procesamiento (Kuntawee and Akarapisan, 2015; Lu et al., 2022).

Los géneros Aspergillus, Penicillium y Fusarium son los que tienen mayor prevalencia en los granos de café (Garrido-Ramírez et al., 2018), produciendo una variedad de metabolitos secundarios tóxicos como la ocratoxina A [OTA] y, en menor medida, la aflatoxina, producidas en el café por el género Aspergillus (Oliveira et al., 2019; Alves da Silva et al., 2020), estas toxinas pueden presentarse en los granos de café crudos y tostados. Así mismo, otras toxinas como la patulina, fumonisinas, zearalenona y tricotecenos como nivalenol y desoxinivalenol también pueden estar presentes en los granos de café (Organización Mundial de la Salud [OMS], 2018). No obstante, el desarrollo de algunos hongos se puede limitar aplicando ciertas prácticas que propenden conservar las propiedades organolépticas y la calidad del café: la gestión de la humedad desde el principio del secado en adelante y “facilitar la producción de microorganismos competitivos además de limitar las condiciones de desarrollo que no perjudican la calidad del café, antes de este punto” (FAO, 2017, p. 4).

El café como un producto agrícola puede contaminarse y, por tanto, perder su inocuidad y calidad en los procesos realizados en la finca, durante el transporte nacional e internacional y también en los procesos industriales. Estas pérdidas son influenciadas por condiciones climáticas, cuidados agronómicos, variedad sembrada y procesos fitosanitarios del cultivo, así como por los controles efectuados en los procesos de cosecha y postcosecha realizados por los caficultores (Puerta, 2006). Teniendo en cuenta lo descrito, se han implementado las Buenas Prácticas Agrícolas [BPA] como una medida para atenuar esta situación.

EnColombia, el Ministerio de Agricultura y Medio Ambiente, y el Ministerio deSalud y Protección Social son los responsables de establecer los requisitospara dar cumplimiento a las Buenas Prácticas Agrícolas [BPA]. Para lasactividades primarias de producción [relacionadas con preparación,mantenimiento del cultivo y recolección] se deben tener en cuenta requisitos yprincipios de higiene e inocuidad que incluyen: manejo del suelo, selección devariedades, calidad y sanidad del material de propagación, fertilizaciones deacuerdo con necesidades del cultivo, rotación de cultivos, uso adecuado delagua, manejo integrado de plagas y enfermedades, manipulación, empaque,transporte y almacenamiento del producto (Giraldo-Quintero et al., 2017). Por tal motivo, el objetivo deeste estudio fue establecer la prevalencia de hongos filamentosos presentes enla etapa de procesamiento del café [Coffea arabica L.] producido en los diferentes municipios deldepartamento Norte de Santander (Colombia).

Se recolectaron 44 muestras de café en la etapa de producción denominada cereza, obtenidas de los municipios de Norte de Santander [Arboledas, Bochalema, Chinácota, Cucutilla, Ragonvalia, Durania, Toledo y Salazar] como se muestra en la Figura 1. El departamento Norte de Santander está situado en el nororiente de la región andina de Colombia; localizado entre los 06º56’42’ y 09º18’01’’ de latitud norte y los 72º01’13’’ y 73º38’25’’ de longitud oeste, cuenta con una superficie de 22367 km2.

Los granos de café se sometieron a procedimientos microbiológicos y fisicoquímicos, como se aprecia en el resumen gráfico.

El aislamiento de los hongos filamentosos asociados a los granos de café se realizó mediante la siembra directa de granos de café [cuatro granos] en Agar Papa Dextrosa [PDA] con ácido láctico [2 % v/v], los cuales fueron incubados a una temperatura de 25 °C por siete días. Posteriormente, se realizaron nuevos repiques con el objetivo de aislar todas las morfoespecies presentadas en cada muestra.

Los aislamientos fúngicos obtenidos se caracterizaron macroscópica y microscópicamente usando los siguientes medios de cultivo: Agar Extracto de Malta (MEA) (Vieille et al., 2018), Agar Czapek - Extracto de Levadura [CYA] (Vieille et al., 2018) y Carnation Leaf-Piece Agar [CLA] (Peluola et al., 2020). Las caracterizaciones fueron soportadas mediante las claves taxonómicas propuestas por Pitt and Hocking (2009), Leslie et al. (2006) y Barnett and Hunter (1998).

Del total de las cepas aisladas, cuatro de ellas se seleccionaron para su identificación molecular, la cual fue llevada a cabo teniendo en cuenta los iniciadores ITS4 e ITS5 del DNA ribosomal fúngico; el análisis bioinformático se realizó mediante la herramienta BLAST del National Center for Biotechnology Information [NCBI] y la base de datos «UNITE». Además, se hizo un análisis taxonómico de la secuencia mediante la herramienta «Classifier», alojada en el sitio Web «Ribosomal Database Project» [RDP].

Los granos de café se sometieron a la determinación fisicoquímica de estas variables: actividad de agua [Aw], con el equipo HygroPalm HP23-AWA marca Rotronic; pH, usando un pH-metro marca WTW Multi 3430; y porcentaje de humedad [%], mediante el uso de balanza de humedad marca Precisa modelo MX 60.

Las 44 muestras de café cereza se recolectaron de estos municipios de Norte de Santander: Arboledas [5], Bochalema [5], Chinácota [5], Cucutilla [5], Ragonvalia [6], Durania [6], Toledo [6] y Salazar [6]. Para el estudio de cada muestra se consideraron tres repeticiones. Se realizó un análisis de varianza, [ANOVA] a un nivel de significancia del 0,05, con el software STATGRAPHICS Centurión XV. Luego, al encontrar diferencias significativas estadísticamente se aplicaron las pruebas de comparación múltiple o post-hoc de TUKEY. Finalmente, se aplicó el análisis discriminante con el fin de obtener los coeficientes para las variables fisicoquímicas: actividad de agua [Aw], pH y porcentaje [%] de humedad de los granos de café cereza, que se utilizarán para la clasificación de nuevos casos.

AISLAMIENTO DE HONGOS FILAMENTOSOS E IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA

De las 44 muestras de café, recolectadas en ocho (8) municipios deNorte de Santander, se obtuvieron 60 aislamientos, los cuales se sometieron acaracterización fenotípica. En la Figura 2se presentan las características fenotípicas de los aislamientos fúngicos másprevalentes, a partir de los granos de café recolectados en los diferentesmunicipios de Norte de Santander.

Una vezrealizada la caracterización macroscópica y microscópica de los aislamientos,se estableció la presencia de cada uno de los géneros en los municipiosmuestreados, tal y como se aprecia en la Figura 3, destacándose la prevalenciade los siguientes géneros fúngicos: Aspergillus spp.,Fusarium spp., Penicillium spp., Geotrichum spp. y Mucor spp.

Los municipios de Bochalema, Chinácota, Durania, Ragonvalia y Toledo, ubicados en la zona oriental del departamento Norte de Santander y debido a la interrelación de las variables fisicoquímicas establecidas en los granos de café, evidenciaron un mayor grupo de géneros fúngicos. Los granos procedentes del municipio de Ragonvalia mostraron la presencia de los cinco géneros fúngicos determinados; los obtenidos de los municipios de Bochalema, Chinácota y Toledo presentaron tres géneros diferentes. Por su lado, los municipios de Salazar y Arboledas mostraron una interrelación homogénea entre las variables fisicoquímicas y un menor número de micobiota. Los granos de café del municipio de Salazar sólo evidenciaron presencia de Fusarium spp. y en los de Arboledas se exhibieron los géneros Penicillium spp. y Geotrichum spp.

Los géneros Fusarium spp. (35 %), Penicillium spp. (25 %), Geotrichum spp. (22 %), Aspergillus spp. (15 %) y Mucor spp. (3 %) se destacan por ser los más frecuentes. Estos resultados son similares a los obtenidos en estudios de biodiversidad de hongos filamentosos en granos de café reportados por (Cajiao et al., 2016; Casas-Junco et al., 2017; Alves da Silva et al., 2020; López-Lima et al., 2020 Lu et al., 2022). De igual manera, se relacionan con los resultados reportados por Garrido-Ramírez et al. (2018), quienes identificaron 25 géneros y especies de hongos, siendo Aspergillus spp. el género prevalente, seguido de Penicillium spp., Fusarium spp., Curvularia spp., Rhizopus spp., Helminthosporium spp. y Pestalotia spp.

A nivel molecular se lograron identificar los géneros Aspergillus spp., Fusarium spp., y Penicillium spp., hongos que revisten importancia porque pueden sintetizar micotoxinas en los granos de café (Vieira et al., 2015; Huch et al., 2015). También se destaca la presencia de Geotrichum candidum, considerado un hongo filamentoso levaduriforme (Eliskases-Lechner et al., 2022), causante de la podredumbre agria de las frutas con hueso (Henríquez et al., 2021). G. candidum está restringido a hábitats con alta actividad de agua, como suelos, ensilados, plantas, frutas (Hernández et al., 2018), y no se conoce que produzca compuestos tóxicos; las infecciones por este patógeno se originan principalmente a través de las heridas en la superficie de los frutos durante la recolección o en el manejo postcosecha (Liu et al., 2010).

Es importante resaltar que las levaduras presentes en el café realizan procesos fermentativos. Lee et al. (2017) encontraron una gran variedad de levaduras en granos de café, pero ellos manifiestan que la selección natural da como resultado el predominio de un número restringido de especies de estas; lo anterior depende de su capacidad para hacer frente a variaciones de pH, entre otros parámetros. Por otro lado, las transformaciones bioquímicas que son necesarias para una fermentación normal en el café pueden ser realizadas por muchas especies diferentes de levaduras, siempre que tengan la capacidad fisiológica adecuada (Haile and Kang, 2019). En el procesamiento seco del café, las levaduras coexisten con bacterias y mohos; en el procesamiento húmedo del café, determinados grupos microbianos pueden dominar en los tanques de fermentación reutilizados y pueden ser bacterias o levaduras (Huch et al., 2015; Haile and Kang, 2019).

También se identificó la especie Aspergillus flavus, de gran relevancia por tener la capacidad de producir aflatoxinas [metabolitos secundarios que se han detectado como contaminantes naturales en un gran número de productos agrícolas]. Se han encontrado aflatoxinas en semillas oleaginosas, aceites vegetales, frutos secos, en el café y el cacao, cereales y derivados (Echodu et al., 2019; Liverpool-Tasie et al., 2019) y pueden tener un efecto negativo en la salud de los organismos vivos. Específicamente, la aflatoxina B1 es considerada por la International Agency For Research on Cancer (IARC, 2012), como cancerígeno en animales de experimentación, también se ha clasificado como cancerígeno humano (grupo I), y es la de mayor importancia en salud pública (Echodu et al.,2019; McCullough et al., 2019).

Con relación a las variables fisicoquímicas, en la Tabla 2 se presentan los resultados de los grupos homogéneos con las pruebas de múltiples rangos, a partir de un análisis de conglomerados.

Teniendo los grupos homogéneos de la prueba de múltiples rangos, el método Tukey permite detectar diferencias entre dos medias muestrales estrechamente relacionadas, para considerar que dos tratamientos son estadísticamente diferentes. Según la variable de actividad de agua [Aw], el superíndice [a] indica que no existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias muestrales de Arboledas y Chinácota, con un nivel del 0,5; pero sí entre Arboledas y Cucutilla. Este mismo análisis se aplica para cada uno de los superíndices en cada variable fisicoquímica. Dichos resultados permiten inferir la presencia de diferentes especies de mohos filamentosos en el café cereza de los municipios muestreados.

En la Figura 4 se muestra la discriminación de las variables fisicoquímicas de las muestras de café cereza procedentes de los municipios estudiados, resaltando dos grandes grupos asociados a dichas variables. En el grupo A se infiere que los granos de café procedentes de Arboledas, Cucutilla y Salazar presentan características fisicoquímicas con mayor dispersión. Por otro lado, el grupo B, conformado por los municipios restantes, revela una aproximación geográfica, lo que evidencia características geoclimáticas que favorecen la proliferación de los hongos aislados.

Atendiendo a la Figura 4 y a los coeficientes de la función declasificación para procedencia, se pueden utilizar las funciones 1 [0,011289*Aw + 0,071225*Humedad + 0,991358*pH] y 2 [0,88468*Aw -0,583126*Humedad - 0,116592*pH],para determinar la posible procedencia de una muestra en cuestión, si sereemplazan los datos de las variables fisicoquímicas. Es decir, se obtienen dosdatos, uno de cada función, y con esos valores se identifica la posibleprocedencia de la muestra.

Se aislaron y determinaron 60 cepas axénicas de mohos filamentosos, gracias a la caracterización macroscópica y microscópica y al uso de claves taxonómicas. Tales aislamientos correspondieron a 5 géneros de Aspergillus spp., Fusarium spp., Geotrichum spp., Mucor spp. y Penicillium spp. Los hongos que presentaron mayor prevalencia en los granos de café en los diferentes municipios fueron: Fusarium spp. [35 %], Penicillium spp. [25 %], Geotrichum spp. [22 %] y Aspergillus spp. [15 %]. La identificación molecular permitió confirmar la identidad de cuatro géneros determinados por la caracterización fenotípica, correspondiendo a los géneros Aspergillus spp., Fusarium spp., Geotrichum spp. y Penicillium spp. Sin embargo, dos de estos aislamientos pudieron identificarse a nivel de especie, como lo son Aspergillus flavus y Geotrichum candidum.

Las variables fisicoquímicas [pH, actividad de agua y porcentaje de humedad] condicionan el crecimiento y proliferación de los hongos en el grano de café, dicho comportamiento juega papel importante en las condiciones medioambientales requeridas por estos hongos, ya que este tipo de café contiene altos porcentajes de humedad y valores elevados de Aw. Además, los valores de pH son óptimos para el crecimiento de hongos, lo que hace que el café tipo cereza sea más susceptible a la colonización de mohos, tanto de los toxigénicos como de los que no tienen este potencial. Teniendo en cuenta lo anterior, los resultados obtenidos permiten conocer la diversidad fúngica presente en los granos de café cereza y establecer relaciones entre esta y el potencial micotoxigénico de las cepas aisladas, que depende de factores geográficos, climáticos y del procesamiento del café cereza en Norte de Santander.