Contextualización: Fusarium graminearum es un microorganismo de campo que afecta a gramíneas y causa grandes pérdidas, particularmente a cultivos de arroz. Para contrarrestar estos problemas fitosanitarios se aplican cantidades excesivas de plaguicidas, lo que causa daños a la salud y el ambiente. Una alternativa son los extractos vegetales con alto contenido de compuestos bioactivos.

Vacío de conocimiento: los taninos tipo pirogalol contenidos en las vainas de Caesalpinia spinosa poseen propiedades biológicas, la inhibición del crecimiento micelial de Fusarium graminearum es efectiva en concentraciones bajas de UFC/ml.

Propósito del estudio: el objetivo de esta investigación fue determinar in vitro la actividad antifúngica de los compuestos fenólicos de la tara (Caesalpinia spinosa) frente a Fusarium graminearum.

Metodología: en primer lugar, se extrajeron los compuestos fenólicos por maceración y calentamiento (60 °C) mediante agua y una mezcla agua-etanol. Se determinó el contenido de compuestos fenólicos en los extractos mediante el método de Folin-Ciocalteu. En segundo lugar, se aisló una cepa de Fusarium obtenida de un cultivo de arroz y se identificó por claves taxonómicas; después, se realizaron suspensiones celulares con concentraciones 10⁷ y 10⁶ UFC/ml. Para la evaluación in vitro, un disco con inóculo de cada suspensión se colocó en medio cultivo agar papa dextrosa que contenía extracto de Caesalpinia spinosa.

Resultados y conclusiones: el extracto acuoso por calentamiento con un contenido de 5,88 g ácido gálico/100 g muestra seca inhibió 30 y 70% de crecimiento micelial de Fusarium graminearum a una concentración de 10⁷ y 10⁶ UFC/ml respectivamente. Compuestos fenólicos de Caesalpinia spinosa presentaron propiedades de interés para el control de Fusarium graminearum y pueden ser ensayados in vivo e invernadero.

Un cultivo transitorio que se ve afectado por el ataque de microorganismos en el campo es el arroz, un cereal de importancia mundial que es un alimento básico para aproximadamente 3,500 millones de personas (Muthayya et al., 2014 ). En el 2017 se produjeron aproximadamente 503 millones de toneladas métricas (t) en todo el mundo (FAO, 2018). Entre 2016 y 2017 (de abril a mayo) en Ecuador, la producción de arroz fue de 660 mil t; 90 mil t menos que durante el periodo 2015 – 2016. Esta diferencia ocurrió a causa del fenómeno del Niño y el ataque de plagas y enfermedades (Beillard & Vega, 2016). Se ha demostrado la presencia de Bipolaris oryzae, Fusarium sp., Phoma sp., Phyllosticta sp., agentes causales de enfermedades en el grano que disminuyen la producción de arroz (Solis, 2016).

Por su parte, especiesdel género Fusarium se consideran principalmente como hongos de campo (Villa et al., 2014);son de particular estudioporque pueden causar hasta el 90% de pérdidas en la cosecha (Briones, 2014) en monocultivos, como es el caso del arroz, yafectan la envoltura ocasionando la pudrición de la misma (Villanueva et al., 2013; Bigirimana et al., 2015). Los síntomas de Fusarium graminearum en etapa defloración del arroz son manchas de color café claro en las glumas;posteriormente, evolucionan a lesiones marrones de tamaño y formas irregulares;en la etapa de llenado, las glumas son de color purpura; y para la cosecha, losgranos maduros tienen color marrón oscuro (Tabarelliet al., 2019). Actualmente, el control de microorganismosfitopatógenos se realiza mediante técnicas de agricultura convencional (De León et al.,2013),con efectos negativos para la salud humana y daños al medio ambiente. Nuevasinvestigaciones plantean el uso de plaguicidas botánicos que reemplacengradualmente a determinados plaguicidas químicos (Nava et al., 2012).

Por consiguiente, los plaguicidas botánicos no generan resistencia y no se bioacumulan en el medio ambiente; son metabolitos secundarios (fitoquímicos) extraídos de diferentes fuentes vegetales (Laxmishree & Nandita, 2017). Los compuestos bioactivos se componen de alcaloides, taninos, fenoles, flavonoides, terpenos, entre otros (De León et al., 2013). Los compuestos fenólicos tienen varios propósitos en las plantas pero destacan la pigmentación y resistencia a patógenos (Schöneberg et al., 2018).

Por lo tanto, extractos como etanólicos de Glycyrrhiza glabra y Myroxylon balsamum exhibieron actividad antifúngica frente a Fusarium guttiforme (Cerqueira et al., 2015). Extractos de acetato de etilo y metanólicos de Adenophyllum aurantium y Alloispermum integrifolium reducen el crecimiento micelial y esporulación de Fusarium solani y Alternaria alternata (De León et al., 2014). Extractos etanólicos de Phlomis fruticosa poseen actividad inhibitoria contra Aspergillus niger, Fusarium tricintum, Trichoderma viride (Soković et al., 2013).

En particular, la tara (Caesalpinia spinosa), un arbusto de tipo leguminosa originario del Perú que predomina en zonas secas y valles interandinos de Suramérica (He et al., 2016), se aprovecha en la industria química (taninos), alimenticia (aditivo hidrocoloide) y farmacéutica (ácido gálico, antioxidante) (Melo et al., 2013). Los taninos de C. spinosa son usados en medicina tradicional por sus propiedades antiinflamatorios, antimicóticos, antibacterianos, antisépticos, antitumorales y antioxidantes (Murga et al., 2016); su contenido de taninos está en un rango de 0,2 a 25% del total de masa seca, dependiendo de la especie vegetal, tiempo de cosecha, hábitat y método de extracción (Cuong et al., 2020).

El objetivo de este estudio fue determinar in vitro la actividad antifúngica de los compuestos fenólicos de tara (Caesalpinia spinosa) frente a Fusarium graminearum.

Se recolectaron vainas completamente maduras de Caesalpinia spinosa mediante el método convencional en el municipio de Guachapala, perteneciente a la provincia del Azuay, durante el mes de abril del 2017; se seleccionaron cinco árboles al azar y, en total, se colectaron 5 kg de muestra.

Elmaterial vegetal fue secado a temperatura ambiente durante cinco días;posteriormente, se separaron las semillas de la vaina. En este caso, lassemillas no se tuvieron en cuenta. Para la obtención de la harina de C. spinosa se realizó una molienda fina de las vainas enuna licuadora industrial Blender C86, luego se tamizóen un tamiz Advantech Nro. 18 para una granulometríade 1 mm (Aguilar et al., 2012).

En un tubo de ensayo se colocó 1 ml de cada extracto; particularmente, para el extracto acuoso se adicionó una pequeña cantidad de acetato de sodio. Después, se dosificaron a cada muestra 3 gotas de cloruro férrico 5%, la prueba es positiva cuando desarrollan una coloración azul oscura (Delporte, 2010).

Previamente, se disolvió el extracto en una proporción 1:10; en un frasco ámbar, se colocaron 50 μl de muestra, 3950 μl de agua destilada, 250 μl de reactivo de Folin – Ciocalteu; luego de 2 min, se adicionaron 750 μl de carbonato de sodio 20% (v/v); posteriormente se dejaron reposar por 1 h y se midieron a 750 nm la absorbancia.

La curva de calibración se realizó empleando ácido gálico, como estándar, a concentraciones de 200, 150, 100 y 50 ppm. La ecuación de la curva de calibración corresponde a Y = 0,007077 * X + 0,003519, R² = 0,9998. Las muestras se analizaron usando el espectrofotómetro UV – vis Jasco V – 630, los resultados se expresaron en gramos de ácido gálico/100 g muestra seca (g AG/100 g MS) (Flor & Parra, 2017).

Fusarium se aisló de un cultivo de arroz del municipio Arenillas de la provincia el Oro en Ecuador, para la recolección del material biológico se consideraron plantas con fusariosis en la espiga, el diseño de muestreo fue en forma de X que consiste en tomar muestras de cada esquina y del centro de la parcela, por cada punto se seleccionaron al azar 20 plantas, en total se tomó 1 kg de muestra; granos infectados se sumergieron en etanol 70% e hipoclorito de sodio 1% cada uno por 2 min; posteriormente se colocaron en medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) con 50 ppm de gentamicina, en total 10 cajas Petri se incubaron a 26,5 °C por 7 d (Arbito, 2017).

La identificación del hongo se realizó mediante claves taxonómicas establecidas por (Leslie & Summerell, 2006) se analizaron características macroscópicas del micelio: color, aspecto y pigmentación del agar, y características microscópicas como: macroconidias, microconidias y clamidiosporas.

Después del lavado de esporas se preparó una suspensión celular de Fusarium graminearum en agua destilada (el cultivo debía estar en el día 7), y luego se realizó una dilución 1:10 y se colocó una muestra en la cámara de Neubauer. Con la ayuda del microscopio de pantalla Micros Austria se realizó por triplicado el conteo de conidios (Lage et al., 2013).

En medios de cultivo PDA previo a su gelificación se adicionó 5 ml de EAC, luego se implantó un disco con la concentración total de células y/o la dilución 1:10. El control fue inóculo de Fusarium graminearum en un medio PDA sin extracto. Las cajas se mantuvieron a 26,5 °C por 7 d en una estufa Mermmet, cada ensayo se realizó por triplicado.

La capacidad inhibitoria se determinó por la superficie de crecimiento del micelio en cm²: ((Área control – Área tratamiento)/(Área control)). Para obtener los valores correspondientes se consideró el diámetro promedio debido a que el crecimiento de los hongos es radial pero no uniforme (Schöneberg et al., 2018).

Todos los datos obtenidos se analizaron con elsoftware estadístico libre R versión 3.5.2. Los resultados del contenido decompuestos fenólicos en los extractos y la influencia sobre el crecimientomicelial radial se presentaron como medias ± desviación estándar.Diferencias entre tratamientos tanto para los extractos como para la inhibiciónin vitro se evaluaron con el modelo ANOVA de una vía (aov{stats}), con un nivel designificancia de 0,05. Los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzasse evaluaron con la prueba de Shapiro-Wilk (shapiro.test{stats}) y prueba de Levene (leveneTest{car}),respectivamente. Se realizaron comparaciones múltiples por parejas por laprueba de diferencia significativa honesta de Tukey (HSD.test{agricolae}) y los resultados se expresaron como intervalosde confianza al 95%.

Los extractos acuosos e hidroalcohólico presentaron diferentes coloraciones de amarillo leve a amarillo - café, esto se da por la presencia de compuestos tánicos; además se observaron flóculos de color blanco que se atribuyeron a gomas y resinas que posee C. spinosa; De la Cruz (2004) definió a estas gomas o hidrocoloides como biopolímeros que poseen efectos gelificantes.

Los extractos acuosos e hidroalcohólico mostraron una coloración azul oscura, igual característica obtuvieron en Caesalpinia spinosa (Cortez, 2012) y en Raputia heptaphylla (Coy et al., 2014), esta coloración indica que, en las muestras existen taninos del tipo pirogalol. Los taninos son compuestos fenólicos solubles en agua que se dividen en hidrolizables (galotaninos y elágitaninos) presentes en Caesalpinia sp y condensados (proantocianidinas) presentes en Acacia sp (Anttila et al., 2013; Fraga et al., 2020). De acuerdo a Skowyra (2014) el principal componente de los taninos de C. spinosa son basados en el ácido galoilquinico, del cual derivan el ácido gálico, ácido quinico y grupos galoil.

Mediante el método de Folin – Ciocalteu el contenido de CF en EAM, EAC y EHM fueron 4,77 – 5,88 – 4,76 g AG/100 g MS respectivamente (Figura 1). Diferencias entre tratamientos p = 0,0306. Según la prueba Tukey con el tratamiento EAC, se obtuvo un mayor contenido de CF. Según Markom et al., (2007) los taninos hidrolizables se extraen preferentemente con agua o mezclas agua – etanol, razón por la cual EAM y EHM presentaron contenido similar de compuestos bioactivos. Por otro lado, EAC fue superior debido a que al adicionar energía (60 °C) a la extracción se reducen la viscosidad y tensión superficial (Markom et al., 2010) permitiendo que los taninos se liberen de la matriz vegetal debido a la inestabilidad existente (Wang et al., 2019; Cuong et al., 2020). Otra propiedad de los solventes es la constante dieléctrica, agua destilada 78,5 Fm¯¹ y etanol es 24,5 Fm¯¹; según (Cortez, 2012) un solvente con mayor constante dieléctrica extrae mayor contenido de metabolitos secundarios.

En C. spinosaKardelet al., (2013) de determinaron por colorimetríataninos condensados 4,6 mg/g en extractos butanol-ácido clorhídrico; sinembargo, en extractos por agua caliente analizados en HPLC-MS la concentraciónde taninos hidrolizables fue 647 mg/g de equivalentes de epigalocatequinagalato; Játiva(2011) y Cortez(2012) con extractos acuosos obtuvieron42 y 23 g AG/100 g MS respectivamente. Cabe mencionar que las muestras fuerontomadas de árboles que se encontraban en Ecuador. Por otro lado, Aviléset al., (2010) obtuvieron en extractos acuosose hidroalcohólicos 11 y 15 g AG/100 g MS respectivamente, las muestras fueronextraídas de árboles que se encontraban en Perú. Losresultados del contenido de CF difieren a lo reportado en la literatura, porfactores externos los cuales condicionan a la especie vegetal; según Nuñez et al.,(2017) lascaracterísticas del suelo y las condiciones climáticas influyen en laacumulación de compuestos fenólicos; de acuerdo a Nieto & Barahona (2006) losrequerimientos para C. spinosa son: suelos franco arenosos, temperatura 13 a22 °C, humedad relativa < 80% yprecipitaciones < 750 mm. Una posible causa parael bajo contenido de CF son las condiciones del suelo, debido a que los árbolesseleccionados en el muestreo se encontraban en una zona con abundante materiaorgánica.

Lasclaves taxonómicas determinaron que el hongo aislado fue Fusarium graminearum, y suscaracterísticas macroscópicas fueron: micelio bien desarrollado de aspectolanudo algodonoso y de crecimiento rápido; las colonias inicialmente fueron decolor blanco, transcurridos los días se tornaron de color crema; en el reversode la caja Petri el color fue pardo; además, ciertos cultivos presentaronpigmentos rojos en el agar. Por otro lado, las características microscópicasfueron: macroconidia delgada, paredes gruesas,ligeramente curvada, septos entre 4 y 6, célula basal en forma de pie y célulaapical cónica, en esta especie hay ausencia de microconidias y clamidiosporas (Figura2) (Melgarejo et al., 2010; Refai et al., 2015). Pacin et al., (2002) determinaron la presencia de F. graminearumen cultivos de arroz en la región costera de Ecuador.

Através del conteo de células por cámara de Neubauer se obtuvo una concentraciónaproximada a 10⁷ UFC/ml;por ende, la dilución 1:10 tiene una concentración cercana a 10⁶UFC/ml. Con cultivos de F. oxysporum y F. solani el día nueve (Lage et al., 2013) obtuvieron concentraciones 1,8 y 2,8 10⁶UFC/ml, esto demostró la altacapacidad de esporulación de F. graminearum.

La actividadinhibitoria del EAC frente a Fusarium graminearum en concentracióntotal - 10⁷ UFC/ml (CT) y concentración diluida - 10⁶ UFC/ml (CD) se expresaroncomo la superficie de crecimiento del micelio (cm²), control 26,44; (CT+EAC)18,38 y (CD+EAC) 7,89 (Figura 3). Para una mejor comprensión los valores, seconvirtieron en porcentaje de inhibición, control no presentó; (CT+EAC) 30,6% y(CD+EAC) 70,3%. Diferencias entre tratamientos p = 6,18 e¯⁵). Deacuerdo con la prueba Tukey con el tratamiento (CD+EAC) se obtuvieron mayoresporcentajes de inhibición frente al fitopatógeno (Figura 4).

En Fusarium spVeloz et al., (2012) con extractos tánicos de Caesalpinia cacalaco al 1%, se obtuvo una inhibición del 68%; en Penicillium spJátiva (2011) con extractos tánicos de C. spinosa a 2500 y 5000 ppm consiguieron 53 y 87% de inhibición respectivamente, las mismas concentraciones fueron aplicadas a Aspergillus niger y no existió inhibición. Extractos polifenólicos de Acacia farnesiana obtuvieron 98% de inhibición micelial en Fusarium oxysporumRodríguez et al., (2012).

En esta investigación se determinó que EAC de C. spinosa frente a 10⁶ UFC/ml de Fusarium graminearum inhibió 70% de su desarrollo micelial, esto fue posible debido a que el extracto contenía taninos hidrolizables. Al comparar este resultado con otros autores, se puede asumir que extractos de especies pertenecientes a la familia Fabaceae tienen alta capacidad reducir el crecimiento in vitro de hongos filamentosos.

Extractos crudos de Khaya ivorensis y Tetracera potatoria Adekunle et al., (2003); Asphodelus tenuifolius y Euphorbia guyonianaSalhi et al., (2017); Rhus muelleriJasso de Rodríguez et al., (2015); Parthenium hysterophorus, Acacia farnesiana y Pluchea carlinensisRodríguez et al., (2000); Diospyros cuneataRuiz et al., (2016), contienen compuestos fenólicos, terpénicos y alcaloides con actividad inhibitoria de 60 a 87% o capacidad fungicida frente a hongos filamentos como F. graminearum , F. oxysporum, F. sporotrichioides, A. niger, T. viride. En las investigaciones citadas la presencia de compuestos fenólicos junto a otros metabolitos secundarios alcanzaron altos porcentajes de capacidad inhibitoria, lo que demuestra gran potencial para controlar determinados fitopatógenos.

Los compuestos fenólicos obtenidos delextracto crudo de vainas de C. spinosademostraron tener actividad inhibitoria ante el crecimiento micelial de F. graminearuma nivel in vitro. EAC tuvo uncontenido de 5,88 g de AG/100 g MS y la presencia de taninos tipo pirogalotánicos; mediante revisión de literatura seestablecieron que las muestras son ricas en taninos hidrolizables. Respecto ala actividad antifúngica, se obtuvieron 30 y 70% de inhibición frente aconcentraciones de inóculo 10⁷ UFC/ml y 10⁶ UFC/mlrespectivamente. Los resultados dan viabilidad a la realización de estudios in vivo en invernaderos, controlandociertas variables y evaluando el uso de este extracto en un sistema de manejointegrado de plagas.