Contextualización: actualmente se ha incrementado el interés en la producción de microalgas debido a los diferentes usos de la biomasa microalgal en algunos sectores industriales, además de la posibilidad de emplearse en la mitigación de gases de efecto invernadero gracias a su alta capacidad para la captura de CO2.

Vacío de conocimiento: como parte del Acuerdo de Paris en 2015, Colombia se comprometió en reducir un 20% sus emisiones de gases efecto invernadero, con el propósito de contribuir a la meta establecida para 2050; por esta razón, se deben desarrollar investigaciones y planes de acción enfocados a este objetivo.

Propósito del estudio: el propósito de este estudio es evaluar del efecto de la inducción de CO2 en diferentes concentraciones sobre la cinética de crecimiento de Chlorella Vulgaris CV_2714A y Scenedesmus Obliquus SOB_001 en un sistema de fotobiorreactores a escala laboratorio, en un volumen de 3,8 L de medio de cultivo (solución NPK + micronutrientes).

Metodología: los ensayos se realizaron en fotoperiodos con 12 h de luz y 12 h de oscuridad durante 5 días consecutivos. El diseño experimental aleatorizado cuyas fuentes de variación fueron: especie microalgas y dosificación de CO2 (0, 2, 6,5, y 12,8 L. día-1) con iluminación artificial por lámpara fluorescente de 4400 lúmenes. Se estimó la concentración celular por medio de la aproximación numérica en cámara de “Neubauer” con la metodología usada por Darki et al. (2017), además de tasa de crecimiento y tiempo de duplicación celular en días de acuerdo con Andersen, (2005). Los datos fueron sometidos al análisis de varianza y pruebas de medias de Tukey (p < 0,05).

Resultados y conclusiones: los resultados en los diferentes ensayos mostraron mayor concentración celular en C. vulgaris en comparación con S. obliquus. En cuanto al suministro de CO2, las 2 especies obtuvieron respuesta significativamente mayor (p <0,05) a la dosis de 6.5 L. día-1 alcanzando concentración es celulares de 2.59 x 107 cel.ml-1 y 4.62 x 106 cel.ml-1 respectivamente. Estos resultados permiten concluir que el cultivo de estas microalgas asociado a la dosis de CO2 puede favorecer a su rápido crecimiento y producción de biomasa, al tiempo que, también puede contribuir a otros estudios sobre disminución de gases de efecto invernadero.

El aumento incesante de emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) ha llevado al calentamiento global y como consecuencia el actual cambio climático (Intergovernmental Panel on Climate Change, 2014). Las actividades antrópicas como la incineración de combustibles fósiles y también la deforestación han derivado en una emisión intensiva de estos gases (Sanclemente, 2012), siendo el dióxido de carbono (CO2), el principal gas que ha aumentado su concentración en la atmosfera llegando a superar los 400 ppm (Blunden, Arndt, & Hartfield , 2018) y contribuyendo con el 70% del total de las emisiones de GEI (Patiño, 2018). El cambio climático ha causado sequias extremas e inundaciones que afectan profundamente la salud de las personas, desencadenando brotes y enfermedades infecciosas, además de los graves daños a la infraestructura colapsando los servicios de salud (Organización Mundial de la Salud & Organización Meteorológica Mundial., 2012) y agotando los recursos medicinales (Mosquera et al. 2019).

El cambio climático que se vive actualmente es una realidad innegable que desde el año1950 y ha registrado cambios sin precedentes (IPCC, 2014), convirtiéndose en uno de los principales desafíos para la agricultura principalmente en condiciones ambientales del trópico debido a los efectos generados como las heladas, las sequias o las inundaciones (Ararat, 2014). Esto genera la necesidad de tomar medidas inmediatas que permitan solucionar de manera eficaz y económica los problemas de productividad que ponen en riesgo la seguridad alimentaria (Sierra, 2015) y posibles afectaciones a servicios ecosistémicos de abastecimiento (Monsalve et al., 2019).

En la mayoría de las fuentes hídricas de la tierra coexiste una gran diversidad de microorganismos que poseen la capacidad de usar fotones como fuente energética para el desarrollo de su proceso de metabolismo. Un ejemplo de estos son las cianobacterias y las microalgas que transforman el CO2 atmosférico en azucares, lípidos y oxigeno mediante el proceso de la fotosíntesis, siendo las responsables de la producción de más del 50% del oxígeno global (Enzing et al., 2014). Estos microorganismos interactúan dentro de su hábitat con componentes orgánicos e inorgánicos ayudando a mantener el equilibrio y desarrollando un papel vital con relación a los demás organismos acuáticos (Pulido et al 2019).

Las microalgas tienen un crecimiento suficientemente rápido y pueden producir mayores cantidades de biomasa comparadas con las plantas superiores terrestres; además, su capacidad de adaptación al medio de cultivo y la disponibilidad de nutrientes es una de sus ventajas evolutivas de mayor relevancia (Venkata et al, 2015). Estos microorganismos poseen la capacidad de desarrollarse en medios con altos niveles de CO2, haciendo que sean perfectos para ser cultivadas con los gases residuales de la combustión emitidos por las industrias e incluso, usar las aguas residuales domésticas, agrícolas e industriales como medio de cultivo gracias su habilidad de adaptación o ajuste al medio, permitiéndoles incorporar nutrientes como nitrógeno (N) y fosforo (P) en sus procesos metabólicos (Lee, 2015).

En el proceso o ajuste fotosintético actúan 2 grupos de reacciones, el primero está asociado a reacciones dependientes de la luz solar, en estas fuerzas se da la absorción y transmisión de la energía de los fotones, encapsulamiento de la energía y la formación del compuesto Nicotinamida-Adenina-Dinucleótido-Fosfato (NADPH) y Adenosín Trifosfato (ATP); Durante estos procesos se facilita la oxidación fotoquímica de la molécula de agua liberando átomos de oxígeno como un subproducto (Barsanti, 2006). El segundo grupo de reacciones son las independientes de la luz. En este proceso las moléculas NADPH y ATP se utilizan para la fijación o adherencia del CO2 en la formación de carbohidratos. Estas reacciones no ocurren en ausencia de la luz aun cuando sean independientes de la misma, ambas reacciones se dan de forma simultánea y se conocen como Ciclo de Calvin (Barsanti, 2006).

El cultivo de microalgas a gran escala se ha desarrollado durante décadas con fines farmacéuticos y para consumo humano; sin embargo, la idea de cultivarlas como fuente energética aparece solo hasta 1950 y solo se consideró importante 20 años después debido al incremento del precio del petróleo, donde se evaluó ampliamente el potencial de las microalgas para la producción de biodiesel (Farroq, 2015). En esta dirección, la combinación de la fijación biológica del CO2 mediante microalgas junto con el método de aguas residuales con el objetivo de obtener biodiesel se convierte en una estrategia atractiva para la mitigación biológica del CO2, siendo más viable económicamente y sostenible ambientalmente (Razzak, 2017). El biocombustible producido a partir de la biomasa de microalgas podría ser una buena alternativa a los combustibles derivados del petróleo, gracias a que pueden ser utilizados sin problemas en los sistemas de combustión actuales, además del incremento en la tendencia a la utilización de biocombustibles a nivel mundial (Ramírez, 2017).

Algunos estudios revelan que la cinética de crecimiento de varias especies de microalgas está estrechamente relacionada con las concentraciones de CO2 adicional utilizadas durante su cultivo. Esto indica que estas especies se pueden utilizar en la fijación biológica del CO2 con fines ambientales; por ejemplo, la prevención y conservación de ecosistemas en estudios de caso citados por Montenegro et al (2019), y a su vez en la búsqueda de la producción de biomasa para la producción de biocombustibles y otros productos de alto valor (Kassim, 2017). El objetivo principal de este estudio fue evaluar el efecto de la dosificación de CO2 en la cinética de crecimiento de las microalgas C. vulgaris y S. obliquus, en condiciones controladas de un sistema de compuesto por 3 fotobiorreactores a escala laboratorio, con un fotoperiodo aproximado de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y tres dosificaciones de CO2.

El estudio se llevó a cabo en la ciudad de Santiago de Cali (Valle del Cauca), Colombia, en un sitio ubicado en las coordenadas 3°25´0.58´´ N 76°31´9.49´´ W. El montaje del experimento está situado a una altura de 956 m.s.n.m. cuya temperatura promedio anual es de 24°C.

Se utilizaron las cepas de las microalgas Chlorella Vulgaris CV-2714A y Scenedesmus Obliquus SOB-001 provistas por la empresa NUTRE S.A.S de Bogotá D.C., Colombia. Los medios de cultivo fueron elaborados con las siguientes concentraciones: 0.8 g.L-1 de N total, 0.5 g.L-1 de K2O y 0.5 g.L-1 de P2O5, según lo indicado en la metodología propuesta por Ammar et al. (2016), considerando las concentraciones porcentuales de cada nutriente y a través de una regla matemática se calculó la cantidad en gramos por utilizar de cada fertilizante para estimar la concentración final (CF) de cada nutriente en los medios de cultivo. Para la preparación de los medios de cultivo se usaron los fertilizantes comerciales de uso agrícola, TODO EN UNO 42-0-0 (SUPERABONO S.A.S. Bogotá, Colombia), FOSFACEL 20-53-0 (COSMOAGRO S.A. Palmira, Colombia), Nitrato de potasio 13-0-44 (MICROFERTISA S.A. Bogotá, Colombia) y NITRAX-S, 28-4-0-6 (YARA. Cartagena, Colombia).

Se elaboró una cámara de cultivo experimental con las siguientes características: 130 cm de largo, 30 cm de fondo y 50 cm de alto, extracción controlada de aire, luminaria artificial y dos temporizadores para administrar el manejo del fotoperiodo y la dosificación de aire y CO2 a un 87.65% de pureza. Como fotobiorreactores se emplearon botellas plásticas con capacidad de 4L, el ensayo se realizó diseño experimental completamente al azar de 6 tratamientos con 3 réplicas (Tabla 1) en 5 tiempos de muestreo. Los fotobiorreactores se enlazaron a un sistema de inyección alternado de aire con un flujo preciso de 0.7 L.min-1 y con un flujo de CO2 de 0.15 L.min-1 basado en la metodología diseñada por Razzak et al. (2017). Se suspendió temporalmente la dosificación de CO2 durante la fase oscura del fotoperiodo.

Se emplearon 3 intervalos de dosificación de CO2 para cada una de las cepas, para un total de 6 ensayos (Tabla 1).

El fotoperiodo se ejecutó por medio de iluminaciónartificial con asistencia de una lámpara fluorescente (SYLVANIA) de luz blanca(54W_4400 lúmenes). La duración de cada ensayo fue de 5 días en cada una de lasdosificaciones utilizadas. La temperatura promedio de la cámara de cultivo seconservó entre 26 y 31°C.

La cuantificación dela concentración de células y la evaluación de la cinética del crecimientoestimado se realizó mediante la metodología de recuento celular en microscopioóptico (Amscope B120c, Irvine, California) y cámara de Neubauer (Marienfeld,Lauda-Königshofen, Alemania), el cálculo de la concentración se realizómediante la ecuación 1, realizando conteos diarios del número de células comolo propone la metodología usada por Darki etal. (2017).

La velocidadespecífica del crecimiento de estas cepas se calculó a través de la ecuación 2 (Andersen, 2005):

Donde:

Ln CV es logaritmo natural de concentración celular por volumen de medio de cultivo.

tf y ti son los tiempos (final e inicial respectivamente) del ensayo.

El tiempo de duplicación determinado en días, es el tiempo requerido para la duplicación de células, el cual se calculó a partir de la tasa de crecimiento por medio de la ecuación 3 (Andersen, 2005):

Los datos obtenidospara cada cepa de microalga se sometieron a un análisis de varianza de dosfactores (ensayos vs tiempo de crecimiento) y pruebas de medias de Tukey (p <0.05) para determinar las diferencias significativas entre los ensayos yposteriormente la estimación de la concentración celular en función de lavariable “dosificación de CO2” para las 2 especies de microalgas (C. vulgaris y S. obliquus). Preliminarmente, se confirmó la normalidad de losdatos a través de la prueba de Shapiro Wilks para cada momento de muestreo (W:estadístico > valor crítico: VC). Para el procedimiento (PROC) GLM, pruebadel rango estudentizado, se utilizó el programa estadístico SAS versión9.3. Las gráficas de las curvas de crecimiento se realizaron mediante softwareExcel 2016.

Lainteracción de la temporalidad en las dos especies de microalgas se ilustra enla figura 1, observándose diferencias significativas en las estimacionespoblacionales según los días de observación y los ensayos (E) correspondientesa la dosificación de CO2.

La Figura 2 ilustrala curva de crecimiento de la cepa C.vulgaris, la cual manifestó que la fase exponencial en E1 y E3 inicio apartir del día 1, mientras que en E2 inició desde el día 0 siendo este ensayodonde se alcanzó la densidad celular más alta con 2.59 x 107 cel.ml-1. En el ensayo E3 ladensidad celular alcanzada fue de 1.03 x 107 cel.ml-1, una densidad mayor que lalograda en E1. Finalmente, el ensayo en el que se presentó la menor densidad decélulas fue en E1 con un máximo de 8.67 x 106 cel.ml-1, inferior al obtenido enE3 aun cuando contó con la dosificación de CO2 más alta de los tresensayos. Los resultados obtenidos en los ensayos E1 a E3 se asemejan a losresultados obtenidos por Zheng et al.(2012), en los que los crecimientos más altos se obtuvieron con las dosis de CO2intermedias 1, 5 y 10%. De igual modo, la concentración de CO2 másalta inhibió el crecimiento microalgal y la concentración más baja de CO2produjo un crecimiento limitado. Por su parte, Ortiz et al (2014) indica que el uso de aire enriquecido con CO2a concentraciones del 2, 4, 8 y 16% como fuente de carbono produceconcentraciones altas de biomasa, permitiendo usar con éxito la microalga C. vulgaris en la mitigación de CO2de las emisiones industriales.

En la tabla 2 sepresenta la cinética de crecimiento por C.vulgaris, ratificando que E2 tuvo mayor velocidad específica de crecimiento(0.62 d-1),en comparación con E1y E3, y un menor tiempo de duplicación celular 1.12d. La estimación de estosvalores tiende a generar una estrecha relación con la capacidad productiva delsistema. Para el análisis de varianza elaborado a los ensayos E1 a E3, lavariable densidad de células en C.vulgaris proyectó diferencias altamente significativas entre los 3 ensayos.Estos contrastes estadísticos entre los ensayos E1 y E3 se determinaron con eltest de Tukey a un nivel de confianza del 95% (p<0.05).

El comportamiento de S. obliquus al someterse a diferentes dosis de CO2establecidas en esta metodología se ilustra en la figura 3. La curva decrecimiento muestra que el cambio exponencial para los ensayos E4 a E6 inicia apartir del primer día, en cuanto al crecimiento el ensayo E5, se identifica lamayor densidad de células logrando valoraciones de 4.62 x 106 cel.ml-1. Para el ensayo E4 elmáximo valor obtenido fue de 3.46 x 106 cel.ml-1, mientras E6 mostró lamenor densidad de células cuyo máximo valor no superó 3.03 x 106 cel.ml-1. Estos resultados guardanuna similitud respecto a los resultados obtenidos por Abd El Baky et al. (2012) en los que se cultivó lamicroalga S. obliquus con una mezclade aire y CO2 a concentraciones del 0.3, 3, 9 y 12%, donde laconcentración de biomasa más alta se obtuvo al 9% de CO2.

La Tabla 3 presentavalores estimados a la cinética de crecimiento mostrada por S. obliquus, ratificando que E5 presentómayor velocidad específica de crecimiento 0.27d-1, en comparación conE4 y E6, y su tiempo de duplicación celular fue menor 1.12d. Estas valoracionesindican una relación muy estrecha con la capacidad productiva en el sistema. Enel respectivo análisis de varianza, los ensayos E4 a E6 en la variable “densidadde células” de S. obliquus proyectarondiferencias altamente significativas entre los 3 ensayos. La respectivaestadística entre los ensayos E4 a E6 se determinaron mediante la prueba deTukey a un nivel de confianza del 95% (p < 0.05).

El contraste entre C. vulgaris y S. obliquus de los tres ensayos aplicados (dosificación de CO2 y airecontrolado) a cada especie (figura 4), permite reconocer diferencias estadísticassignificativas, donde se observó que C.vulgaris siempre alcanzó una mayor densidad de células. El análisis devarianza realizado a los ensayos E1 y E4 se presentó diferencia altamentesignificativa en ambas especies evaluadas a las mismas condiciones de dosis deCO2 y aire controlado, siendo la cepa C. vulgaris con un registro máximo de 8.67 x 106 cel.ml-1 mientras S. obliquus alcanzó un máximo valor de 3.46 x 106 cel.ml-1, encontrándose unadiferencia de 2.5 veces más de densidad celular en C. vulgaris. Para l caso de los ensayos E2 y E5, C. vulgaris logró una densidad máxima de 2.59 x 107 cel.ml-1 y la cepa S. obliquus alcanzó un valor máximo de 4.62 x 106 cel.ml-1, permitiendo observar unadensidad celular 5.6 veces mayor en C.vulgaris. Posteriormente, en los ensayos E3 y E6 donde se usó aireatmosférico, la cepa C. vulgarisobtuvo un valor máximo de 1.03 x 107 cel.ml-1 y la cepa S. obliquus alcanzó una densidad máximade 3.03 x 106 cel.ml-1, generando una diferenciade 3.4 veces más densidad celular en C.vulgaris.

La dosificación de CO2 adicional benefició la cinética del crecimiento de las 2 especies, especialmente en C. vulgaris, donde la cantidad de CO2 dosificado en E2 y E5 mostró los valores de densidad celular más altos para ambas especies de microalgas, siendo la condición más favorable de todos los ensayos realizados para mejorar su productividad.

Los resultados obtenidos en los ensayos E1 a E3 verificados con la cepa C. vulgaris mostraron que no hay una relación directa entre la cantidad de CO2 dosificado y la densidad de células. Esta situación era esperada ya que, con el uso de solo aire atmosférico, la densidad celular de C. vulgaris en E3, alcanza valores mayores a los obtenidos con una alta dosificación de CO2 como la del ensayo E1.

Los resultados obtenidos en este estudio mostraron que las microalgas C. vulgaris y S. obliquus tienen alto potencial para ser utilizadas en cultivos con condiciones controladas que busquen objetivos como la captura de CO2 y producción de biomasa.