RESUMEN GRÁFICO

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1. INTRODUCCIÓN

El aumento incesante de emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) ha llevado al calentamiento global y como consecuencia el actual cambio climático (Intergovernmental Panel on Climate Change, 2014). Las actividades antrópicas como la incineración de combustibles fósiles y también la deforestación han derivado en una emisión intensiva de estos gases (Sanclemente, 2012), siendo el dióxido de carbono (CO₂), el principal gas que ha aumentado su concentración en la atmosfera llegando a superar los 400 ppm (Blunden, Arndt, & Hartfield , 2018) y contribuyendo con el 70% del total de las emisiones de GEI (Patiño, 2018). El cambio climático ha causado sequias extremas e inundaciones que afectan profundamente la salud de las personas, desencadenando brotes y enfermedades infecciosas, además de los graves daños a la infraestructura colapsando los servicios de salud (Organización Mundial de la Salud & Organización Meteorológica Mundial., 2012) y agotando los recursos medicinales (Mosquera et al. 2019).

El cambio climático que se vive actualmente es una realidad innegable que desde el año1950 y ha registrado cambios sin precedentes (IPCC, 2014), convirtiéndose en uno de los principales desafíos para la agricultura principalmente en condiciones ambientales del trópico debido a los efectos generados como las heladas, las sequias o las inundaciones (Ararat, 2014). Esto genera la necesidad de tomar medidas inmediatas que permitan solucionar de manera eficaz y económica los problemas de productividad que ponen en riesgo la seguridad alimentaria (Sierra, 2015) y posibles afectaciones a servicios ecosistémicos de abastecimiento (Monsalve et al., 2019).

En la mayoría de las fuentes hídricas de la tierra coexiste una gran diversidad de microorganismos que poseen la capacidad de usar fotones como fuente energética para el desarrollo de su proceso de metabolismo. Un ejemplo de estos son las cianobacterias y las microalgas que transforman el CO₂ atmosférico en azucares, lípidos y oxigeno mediante el proceso de la fotosíntesis, siendo las responsables de la producción de más del 50% del oxígeno global (Enzing et al., 2014). Estos microorganismos interactúan dentro de su hábitat con componentes orgánicos e inorgánicos ayudando a mantener el equilibrio y desarrollando un papel vital con relación a los demás organismos acuáticos (Pulido et al 2019).

Las microalgas tienen un crecimiento suficientemente rápido y pueden producir mayores cantidades de biomasa comparadas con las plantas superiores terrestres; además, su capacidad de adaptación al medio de cultivo y la disponibilidad de nutrientes es una de sus ventajas evolutivas de mayor relevancia (Venkata et al, 2015). Estos microorganismos poseen la capacidad de desarrollarse en medios con altos niveles de CO₂, haciendo que sean perfectos para ser cultivadas con los gases residuales de la combustión emitidos por las industrias e incluso, usar las aguas residuales domésticas, agrícolas e industriales como medio de cultivo gracias su habilidad de adaptación o ajuste al medio, permitiéndoles incorporar nutrientes como nitrógeno (N) y fosforo (P) en sus procesos metabólicos (Lee, 2015).

En el proceso o ajuste fotosintético actúan 2 grupos de reacciones, el primero está asociado a reacciones dependientes de la luz solar, en estas fuerzas se da la absorción y transmisión de la energía de los fotones, encapsulamiento de la energía y la formación del compuesto Nicotinamida-Adenina-Dinucleótido-Fosfato (NADPH) y Adenosín Trifosfato (ATP); Durante estos procesos se facilita la oxidación fotoquímica de la molécula de agua liberando átomos de oxígeno como un subproducto (Barsanti, 2006). El segundo grupo de reacciones son las independientes de la luz. En este proceso las moléculas NADPH y ATP se utilizan para la fijación o adherencia del CO₂ en la formación de carbohidratos. Estas reacciones no ocurren en ausencia de la luz aun cuando sean independientes de la misma, ambas reacciones se dan de forma simultánea y se conocen como Ciclo de Calvin (Barsanti, 2006).

El cultivo de microalgas a gran escala se ha desarrollado durante décadas con fines farmacéuticos y para consumo humano; sin embargo, la idea de cultivarlas como fuente energética aparece solo hasta 1950 y solo se consideró importante 20 años después debido al incremento del precio del petróleo, donde se evaluó ampliamente el potencial de las microalgas para la producción de biodiesel (Farroq, 2015). En esta dirección, la combinación de la fijación biológica del CO₂ mediante microalgas junto con el método de aguas residuales con el objetivo de obtener biodiesel se convierte en una estrategia atractiva para la mitigación biológica del CO₂, siendo más viable económicamente y sostenible ambientalmente (Razzak, 2017). El biocombustible producido a partir de la biomasa de microalgas podría ser una buena alternativa a los combustibles derivados del petróleo, gracias a que pueden ser utilizados sin problemas en los sistemas de combustión actuales, además del incremento en la tendencia a la utilización de biocombustibles a nivel mundial (Ramírez, 2017).

Algunos estudios revelan que la cinética de crecimiento de varias especies de microalgas está estrechamente relacionada con las concentraciones de CO₂ adicional utilizadas durante su cultivo. Esto indica que estas especies se pueden utilizar en la fijación biológica del CO₂ con fines ambientales; por ejemplo, la prevención y conservación de ecosistemas en estudios de caso citados por Montenegro et al (2019), y a su vez en la búsqueda de la producción de biomasa para la producción de biocombustibles y otros productos de alto valor (Kassim, 2017). El objetivo principal de este estudio fue evaluar el efecto de la dosificación de CO₂ en la cinética de crecimiento de las microalgas C. vulgaris y S. obliquus, en condiciones controladas de un sistema de compuesto por 3 fotobiorreactores a escala laboratorio, con un fotoperiodo aproximado de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y tres dosificaciones de CO₂.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se llevó a cabo en la ciudad de Santiago de Cali (Valle del Cauca), Colombia, en un sitio ubicado en las coordenadas 3°25´0.58´´ N 76°31´9.49´´ W. El montaje del experimento está situado a una altura de 956 m.s.n.m. cuya temperatura promedio anual es de 24°C.

Se utilizaron las cepas de las microalgas Chlorella Vulgaris CV-2714A y Scenedesmus Obliquus SOB-001 provistas por la empresa NUTRE S.A.S de Bogotá D.C., Colombia. Los medios de cultivo fueron elaborados con las siguientes concentraciones: 0.8 g.L^-1 de N total, 0.5 g.L^-1 de K₂O y 0.5 g.L^-1 de P₂O₅, según lo indicado en la metodología propuesta por Ammar et al. (2016), considerando las concentraciones porcentuales de cada nutriente y a través de una regla matemática se calculó la cantidad en gramos por utilizar de cada fertilizante para estimar la concentración final (CF) de cada nutriente en los medios de cultivo. Para la preparación de los medios de cultivo se usaron los fertilizantes comerciales de uso agrícola, TODO EN UNO 42-0-0 (SUPERABONO S.A.S. Bogotá, Colombia), FOSFACEL 20-53-0 (COSMOAGRO S.A. Palmira, Colombia), Nitrato de potasio 13-0-44 (MICROFERTISA S.A. Bogotá, Colombia) y NITRAX-S, 28-4-0-6 (YARA. Cartagena, Colombia).

Se elaboró una cámara de cultivo experimental con las siguientes características: 130 cm de largo, 30 cm de fondo y 50 cm de alto, extracción controlada de aire, luminaria artificial y dos temporizadores para administrar el manejo del fotoperiodo y la dosificación de aire y CO₂ a un 87.65% de pureza. Como fotobiorreactores se emplearon botellas plásticas con capacidad de 4L, el ensayo se realizó diseño experimental completamente al azar de 6 tratamientos con 3 réplicas (Tabla 1) en 5 tiempos de muestreo. Los fotobiorreactores se enlazaron a un sistema de inyección alternado de aire con un flujo preciso de 0.7 L.min^-1 y con un flujo de CO₂ de 0.15 L.min^-1 basado en la metodología diseñada por Razzak et al. (2017). Se suspendió temporalmente la dosificación de CO₂ durante la fase oscura del fotoperiodo.

Se emplearon 3 intervalos de dosificación de CO₂ para cada una de las cepas, para un total de 6 ensayos (Tabla 1).

Tabla 1.
Dosis de CO₂ suministrada a las microalgas C. vulgaris y S. obliquus en cada uno de los ensayos.

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Ensayo (E): dosificación de CO2	Cepa de microalga	Vol. CO2 L. día-1
E1	C. vulgaris.	12.8
E2	C. vulgaris.	6.5
E3	C. vulgaris.	0.2
E4	S. obliquus.	12.8
E5	S. obliquus.	6.5
E6	S. obliquus.	0.2

El fotoperiodo se ejecutó por medio de iluminación artificial con asistencia de una lámpara fluorescente (SYLVANIA) de luz blanca (54W_4400 lúmenes). La duración de cada ensayo fue de 5 días en cada una de las dosificaciones utilizadas. La temperatura promedio de la cámara de cultivo se conservó entre 26 y 31°C.

Análisis de concentración celular y cinética de crecimiento

La cuantificación de la concentración de células y la evaluación de la cinética del crecimiento estimado se realizó mediante la metodología de recuento celular en microscopio óptico (Amscope B120c, Irvine, California) y cámara de Neubauer (Marienfeld, Lauda-Königshofen, Alemania), el cálculo de la concentración se realizó mediante la ecuación 1, realizando conteos diarios del número de células como lo propone la metodología usada por Darki et al. (2017).

[Ecuación 1]

La velocidad específica del crecimiento de estas cepas se calculó a través de la ecuación 2 (Andersen, 2005):

[Ecuación 2]

Donde:

Ln CV es logaritmo natural de concentración celular por volumen de medio de cultivo.

tf y ti son los tiempos (final e inicial respectivamente) del ensayo.

El tiempo de duplicación determinado en días, es el tiempo requerido para la duplicación de células, el cual se calculó a partir de la tasa de crecimiento por medio de la ecuación 3 (Andersen, 2005):

[Ecuación 3]

Análisis estadístico

Los datos obtenidos para cada cepa de microalga se sometieron a un análisis de varianza de dos factores (ensayos vs tiempo de crecimiento) y pruebas de medias de Tukey (p < 0.05) para determinar las diferencias significativas entre los ensayos y posteriormente la estimación de la concentración celular en función de la variable “dosificación de CO₂” para las 2 especies de microalgas (C. vulgaris y S. obliquus). Preliminarmente, se confirmó la normalidad de los datos a través de la prueba de Shapiro Wilks para cada momento de muestreo (W: estadístico > valor crítico: VC). Para el procedimiento (PROC) GLM, prueba del rango estudentizado, se utilizó el programa estadístico SAS versión 9.3. Las gráficas de las curvas de crecimiento se realizaron mediante software Excel 2016.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La interacción de la temporalidad en las dos especies de microalgas se ilustra en la figura 1, observándose diferencias significativas en las estimaciones poblacionales según los días de observación y los ensayos (E) correspondientes a la dosificación de CO₂.

Figura 1.
Promedios de estimaciones poblacionales para las células de C. vulgaris y S. obliquus en los días de observación (A) y los Ensayos de dosificación (B) (Análisis a través de agrupamiento de Tukey Alfa = 0.05. Los promedios cubiertos por la misma barra no son significativamente diferentes).
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La Figura 2 ilustra la curva de crecimiento de la cepa C. vulgaris, la cual manifestó que la fase exponencial en E1 y E3 inicio a partir del día 1, mientras que en E2 inició desde el día 0 siendo este ensayo donde se alcanzó la densidad celular más alta con 2.59 x 10⁷ cel.ml^-1. En el ensayo E3 la densidad celular alcanzada fue de 1.03 x 10⁷ cel.ml^-1, una densidad mayor que la lograda en E1. Finalmente, el ensayo en el que se presentó la menor densidad de células fue en E1 con un máximo de 8.67 x 10⁶ cel.ml^-1, inferior al obtenido en E3 aun cuando contó con la dosificación de CO₂ más alta de los tres ensayos. Los resultados obtenidos en los ensayos E1 a E3 se asemejan a los resultados obtenidos por Zheng et al. (2012), en los que los crecimientos más altos se obtuvieron con las dosis de CO₂ intermedias 1, 5 y 10%. De igual modo, la concentración de CO₂ más alta inhibió el crecimiento microalgal y la concentración más baja de CO₂ produjo un crecimiento limitado. Por su parte, Ortiz et al (2014) indica que el uso de aire enriquecido con CO₂ a concentraciones del 2, 4, 8 y 16% como fuente de carbono produce concentraciones altas de biomasa, permitiendo usar con éxito la microalga C. vulgaris en la mitigación de CO₂ de las emisiones industriales.

Figura 2.
Ilustración de la curva de crecimiento de C. vulgaris. Ensayos E1 a E3, luminaria artificial de 54 Watts (4400 lm) con fotoperiodo luz: oscuridad (12:12), rango de temperatura 26 – 31°C.
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En la tabla 2 se presenta la cinética de crecimiento por C. vulgaris, ratificando que E2 tuvo mayor velocidad específica de crecimiento (0.62 d^-1), en comparación con E1 y E3, y un menor tiempo de duplicación celular 1.12d. La estimación de estos valores tiende a generar una estrecha relación con la capacidad productiva del sistema. Para el análisis de varianza elaborado a los ensayos E1 a E3, la variable densidad de células en C. vulgaris proyectó diferencias altamente significativas entre los 3 ensayos. Estos contrastes estadísticos entre los ensayos E1 y E3 se determinaron con el test de Tukey a un nivel de confianza del 95% (p<0.05).

Tabla 2.
Estimación de la Cinética de crecimiento de C. vulgaris. Ensayos E1 a E3, luminosidad artificial de 54Watts (4400 lm) con fotoperiodo luz: oscuridad (12:12), rango de temperatura 26°C – 31°C.

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El comportamiento de S. obliquus al someterse a diferentes dosis de CO₂ establecidas en esta metodología se ilustra en la figura 3. La curva de crecimiento muestra que el cambio exponencial para los ensayos E4 a E6 inicia a partir del primer día, en cuanto al crecimiento el ensayo E5, se identifica la mayor densidad de células logrando valoraciones de 4.62 x 10⁶ cel.ml^-1. Para el ensayo E4 el máximo valor obtenido fue de 3.46 x 10⁶ cel.ml^-1, mientras E6 mostró la menor densidad de células cuyo máximo valor no superó 3.03 x 10⁶ cel.ml^-1. Estos resultados guardan una similitud respecto a los resultados obtenidos por Abd El Baky et al. (2012) en los que se cultivó la microalga S. obliquus con una mezcla de aire y CO₂ a concentraciones del 0.3, 3, 9 y 12%, donde la concentración de biomasa más alta se obtuvo al 9% de CO₂.

Figura 3.
Ilustración de la curva de crecimiento de S. obliquus. Ensayos E4 a E6, luminosidad artificial de 54 Watts (4400 lm) con fotoperiodo luz: oscuridad (12:12), rango de temperatura 26°C – 31°C.
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La Tabla 3 presenta valores estimados a la cinética de crecimiento mostrada por S. obliquus, ratificando que E5 presentó mayor velocidad específica de crecimiento 0.27d^-1, en comparación con E4 y E6, y su tiempo de duplicación celular fue menor 1.12d. Estas valoraciones indican una relación muy estrecha con la capacidad productiva en el sistema. En el respectivo análisis de varianza, los ensayos E4 a E6 en la variable “densidad de células” de S. obliquus proyectaron diferencias altamente significativas entre los 3 ensayos. La respectiva estadística entre los ensayos E4 a E6 se determinaron mediante la prueba de Tukey a un nivel de confianza del 95% (p < 0.05).

Tabla 3.
Estimación de la Cinética de crecimiento de S. obliquus. Ensayos E4 a E6, iluminación artificial de 54Watts (4400 lm) con fotoperiodo luz: oscuridad (12:12), rango de temperatura 26°C – 31°C.

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El contraste entre C. vulgaris y S. obliquus de los tres ensayos aplicados (dosificación de CO₂ y aire controlado) a cada especie (figura 4), permite reconocer diferencias estadísticas significativas, donde se observó que C. vulgaris siempre alcanzó una mayor densidad de células. El análisis de varianza realizado a los ensayos E1 y E4 se presentó diferencia altamente significativa en ambas especies evaluadas a las mismas condiciones de dosis de CO₂ y aire controlado, siendo la cepa C. vulgaris con un registro máximo de 8.67 x 10⁶ cel.ml^-1 mientras S. obliquus alcanzó un máximo valor de 3.46 x 10⁶ cel.ml^-1, encontrándose una diferencia de 2.5 veces más de densidad celular en C. vulgaris. Para l caso de los ensayos E2 y E5, C. vulgaris logró una densidad máxima de 2.59 x 10⁷ cel.ml^-1 y la cepa S. obliquus alcanzó un valor máximo de 4.62 x 10⁶ cel.ml^-1, permitiendo observar una densidad celular 5.6 veces mayor en C. vulgaris. Posteriormente, en los ensayos E3 y E6 donde se usó aire atmosférico, la cepa C. vulgaris obtuvo un valor máximo de 1.03 x 10⁷ cel.ml^-1 y la cepa S. obliquus alcanzó una densidad máxima de 3.03 x 10⁶ cel.ml^-1, generando una diferencia de 3.4 veces más densidad celular en C. vulgaris.

Figura 4.
Ilustración de ANOVA – Densidad de células de C. vulgaris y S. obliquus. Ensayos E1 a E6. Prueba de rangos múltiples para (E1, E4), (E2, E5) y (E3, E6). Tukey (p<0.05). Luminosidad artificialde 54 Watts (4400 lm) con fotoperiodo 12:12, rango de temperatura 26°C – 31°C. Las letras en las barras indican las diferencias entre las especies para cada dosis de CO₂ suministrada según prueba de Tukey (p<0.05).
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4. CONCLUSIONES

La dosificación de CO₂ adicional benefició la cinética del crecimiento de las 2 especies, especialmente en C. vulgaris, donde la cantidad de CO₂ dosificado en E2 y E5 mostró los valores de densidad celular más altos para ambas especies de microalgas, siendo la condición más favorable de todos los ensayos realizados para mejorar su productividad.

Los resultados obtenidos en los ensayos E1 a E3 verificados con la cepa C. vulgaris mostraron que no hay una relación directa entre la cantidad de CO₂ dosificado y la densidad de células. Esta situación era esperada ya que, con el uso de solo aire atmosférico, la densidad celular de C. vulgaris en E3, alcanza valores mayores a los obtenidos con una alta dosificación de CO₂ como la del ensayo E1.

Los resultados obtenidos en este estudio mostraron que las microalgas C. vulgaris y S. obliquus tienen alto potencial para ser utilizadas en cultivos con condiciones controladas que busquen objetivos como la captura de CO₂ y producción de biomasa.

Agradecimientos

A la empresa NUTRE S.A.S. la cual contribuyo aportando las cepas de las microalgas y medios de cultivo utilizados durante el desarrollo del proyecto. A el MSc Pablo Gallo, quien contribuyo al desarrollo del análisis de muestras por la técnica de conteo con cámara de Neubauer y por sus consejos en el área de la microbiología que aportaron al buen desarrollo de este proyecto.

Referencias

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Información adicional

CÓMO CITAR: Ararat Orozco, M. C., Sanclemente Reyes, O. E., & Vergara Patiño, L. (2020). Efecto de la dosificación de CO₂ en la cinética de crecimiento de microalgas Chlorella vulgaris y Scenedesmus obliquuss. Revista de Investigación Agraria y Ambiental, 12(1), 89 - 100. https://doi.org/10.22490/21456453.3482

CONTRIBUCIÓN DE LA AUTORÍA: Primer autor: investigación, análisis de datos, conceptualización, escritura – revisión y edición, adquisición de recursos, administrador del proyecto. Segundo autor: investigación, conceptualización, análisis de datos, supervisión, escritura – revisión y edición. Tercer autor: investigación, conceptualización, metodología, logística, escritura – borrador original.

CONFLICTO DE INTERÉS: Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Enlace alternativo

https://hemeroteca.unad.edu.co/index.php/riaa/article/view/3482 (html)

https://hemeroteca.unad.edu.co/index.php/riaa/article/view/3482/4339 (pdf)