in Revista de Investigación Agraria y Ambiental
IDENTIFICACIÓN YCARACTERIZACIÓN DE RIZOBACTERIASNATIVAS FIJADORAS DE NITRÓGENO DE Capsicum sp. DE LA REGIÓNCARIBE COLOMBIANA
Resumen
Contextualización del tema: El uso de inoculantes biológicos o biofertilizantes basados en bacterias promotoras del crecimiento constituye una alternativa biotecnológica sustentable para mejorar la producción agrícola.
Vacío de información: sin embargo, las características ambientales de los agroecosistemas pueden ser muy diferentes entre regiones y estas pueden tener un efecto sobre el crecimiento y supervivencia de dichos inoculantes.
Propósito del estudio: en el presente estudio se aislaron y caracterizaron microorganismos nativos, con capacidad promotora del crecimiento en plantas, que puedan emplearse en los cultivos de la región Caribe de Colombia.
Metodología: Para ello se aislaron bacterias rizosféricas de Capsicum sp. Se identificaron molecularmente por 16S y se determinó su capacidad de fijar nitrógeno en medio Ashby y de solubilizar fosfato en medio NBRIP. Luego se aplicaron inóculos de las bacterias identificadas a plantas de ají y se evaluó su efecto en la promoción del crecimiento vegetal.
Resultados y conclusiones: Los aislados se identificaron como: Achromobacter sp., Bacillus mycoides, Bacillus sp., y Paenibacillus dendritiformis, y su aplicación favoreció el crecimiento vegetal, lo que se evidenció con el aumento de al menos un parámetro de crecimiento, así como la concentración de nitrógeno en los tejidos de las plantas de ají. Finalmente, Achromobacter sp. y B. mycoides fueron los inóculos que arrojaron mejores resultados, indicando su potencial para ser empleados en la agricultura de la región.
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1. INTRODUCCIÓN
El suelo posee propiedades físico-químicas y biológicas que pueden ser alteradas por el uso intensivo de este, conduciendo a su deterioro y afectando su fertilidad (Jaurixje et al., 2013). Entre estos usos está el agrícola que, además, afecta el suelo por el uso de fertilizantes.
Los fertilizantes químicos son benéficos para el sector agrícola; no obstante, su uso desmesurado genera residuos que producen salinización, acidificación, problemas en el drenaje, compactación del suelo y la emanación de gases tóxicos (Jaurixje et al., 2013; Massah & Azadegan, 2016). Una alternativa es el compostaje de materia orgánica y la producción de biofertilizantes usando microorganismos nativos de la región de cultivo, favoreciendo la recuperación de suelos y la producción agrícola sustentable (Sevilla-Perea & Mingorance, 2015; Vassilev et al., 2015; Pérez-Lavalle et al., 2016).
Los biofertilizantes contienen microorganismos beneficiosos que promueven el crecimiento vegetal garantizando la disponibilidad de nutrientes primarios (Vessey, 2003). Sin embargo, existen factores que afectan la eficiencia de estos, como las condiciones ambientales y el tipo de planta cultivada (Malusà et al., 2016). En Colombia se producen y usan biofertilizantes principalmente en la región andina y en la mayoría de los casos emplean micorrizas de los géneros Glomus y Acaulospora, y bacterias de los géneros Azotobacter y Bradyrhizobium (Pérez-Lavalle et al. 2016).
Entre los microorganismos usados en la agricultura se incluyen bacterias que colonizan raíces denominadas rizobacterias o bacterias promotoras del crecimiento vegetal [BPCV] (Plant growth-promoting rhizobacteria [PGPR]), las cuales estimulan el proceso metabólico de las plantas o facilitan la asimilación de nutrientes y promueven la resistencia sistémica inducida (Márquez et al., 2020; Wang et al., 2012).
Las bacterias de los géneros Azospirillum, Azotobacter y Rhizobium han sido las más empleadas como biofertilizantes por mecanismos que incluyen la fijación de nitrógeno, solubilización de fosfatos y síntesis de fitohormonas, que actúan mejorando diferentes estadios del crecimiento vegetal (Jiménez et al., 2011; Pérez-Lavalle et al., 2016). Además, existen otras bacterias promotoras del crecimiento como las pertenecientes a los géneros Bacillus, Enterobacter, Paenibacillus, Pseudomonas y Serratia que pueden ser empleadas como inoculantes biológicos (Cabra-Cendales et al., 2017; Vida et al., 2017; Márquez et al., 2020).
La agricultura de cultivos de ají topito, auyama, cebollín, guayaba, limón, mango y melón son esenciales en la economía del departamento del Atlántico, Colombia (Galvis, 2009); sin embargo, la actividad productiva del municipio de Malambo se ve limitada por sus suelos pobres (Osorio, 2012) y estudios referentes al cultivo del ají picante Capsicum annuum señalan que requiere altas concentraciones de nitrógeno con relación al fósforo y al potasio (Martínez, 2015). En este sentido, el estudio e identificación de BPCV proveniente de suelos del Atlántico tendría ventajas con respecto a cepas comerciales producidas en otras regiones, dada su capacidad natural de adaptación a las características ambientales de origen. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue aislar e identificar bacterias nativas fijadoras de nitrógeno y a partir de esto evaluar la capacidad de ellas de promover el crecimiento del cultivo de ají topito (Capsicum sp.).
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento de microorganismos. Inicialmente se tomaron muestras de suelo rizosférico de plantas de ají en la finca San José de Malambo, departamento del Atlántico (10˚50’45,4884” N; 74˚52’4,764” W), en donde las temperaturas oscilaron entre 23 y 36 °C. Para ello se tomó suelo a los 15 cm de profundidad de varias plantas, formando una muestra compuesta. A partir de las muestras de suelo se realizaron diluciones seriadas (10-1 a 10-7) y se cultivaron en placas con medio Ashby para microorganismos fijadores de nitrógeno (sacarosa, 10 g; NaCl, 0,2 g; KH2PO4, 0,2 g; MgSO4 ·7H2O, 0,2 g; CaSO4·2H2O, 0,1 g; CaCO3, 5 g; agar 15 g; pH 7,0 por cada litro) y se incubaron a 30 °C durante 5 días. Posteriormente, se aislaron colonias puras y se cultivaron en medio NBRIP (National Botanical Research Institute's phosphate growth medium) constituido por: glucosa, 10 g; Ca3PO4, 5 g; MgCl2·6H2O, 5 g; KCl, 0,2 g; (NH4)2 SO4, 0,1 g; agar, 20 g; H2O destilada, 1L; azul de bromofenol, 0,025 g/l para evaluar la capacidad de solubilizar fosfato, luego se les realizó una coloración Gram y se describieron microscópicamente.
Identificación molecular. La identificación molecular de los microorganismos fue llevada a cabo mediante análisis del gen de ARNr 16S y la amplificación de las secuencias se hizo por Colony-PCR (Bergkessel & Guthrie, 2013). La PCR se realizó en condiciones estándar, usando cebadores universales para 16S pA y pc5B (Wilson et al., 1990). Los conjuntos de ADN resultantes de la PCR [amplicones] fueron secuenciados y se analizaron con herramientas bioinformáticas. También se hizo un análisis de parentesco por el procedimiento de agrupamiento de Máxima Verosimilitud, basado en el modelo evolutivo Tamura 3 y distribución gamma, con un método bootstrap de 800 repeticiones, empleando el programa MEGA X.
Efecto de biofertilizantes en el crecimiento vegetal. El ensayo se realizó con plantas de ají topito Capsicum sp., en unaen una parcela libre de malezas, con condiciones de luminosidad y humedaduniformes. Luego se definieron cuatro tratamientos que consistieron en suelo dela parcela y compost de residuos de la finca (1:1), más cuatro de las cepasaisladas; adicionalmente se incluyeron dos tratamientos control sin inocular,uno con suelo solo y otro con la mezcla de suelo y compost. Se emplearonsemillas comerciales de ají (Capsicum sp.) que fueron sembradasen bandejas de germinación. A los 10 días de haber germinado se formaron lasprimeras dos hojas y se hicieron los trasplantes a macetas de 4 kg con elsustrato correspondiente a cada tratamiento.
Cada aisladobacteriano se cultivó en caldo Luria Bertani a 30 °C hastaobtener una densidad celular de 107 UFC/mL.Al quinto día y décimo día, las plantas fueron inoculadas agregando en la base10 mL de suspensión bacteriana. Por su parte, a losdos controles se les agregó 10 mL del medio sinbacteria. Unavez inoculadas las plantas se mantuvieron en cultivo hasta completar los 87días y se realizaron mediciones de variables en 10 plantas por tratamiento paraestimar crecimiento vegetal. A cada planta se le evaluó: longitud del vástago,longitud de la raíz, peso fresco y seco del vástago, peso fresco y seco de laraíz, número de flores, número y peso total de frutos. Por último, se realizóun análisis foliar para cada tratamiento a través del laboratorio comercialcertificado.
Análisis estadístico. Lasvariables de medición de crecimiento se estudiaron empleando un análisis devarianza de una vía, con nivel de significancia α = 0,01 F (0,99;5/54). Además,se realizó una Prueba de Tukey (α=0,05) para determinar diferenciasverdaderamente significativas entre tratamientos para cada variable. El manejoy análisis de datos se realizó empleando el programa Excel de Microsoft Office.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento e identificación de microorganismos. Se obtuvieron cinco aislados con morfología de colonia diferentes en medio para fijadores de nitrógeno. Los aislados A1, A2 y A5 resultaron ser bacilos Gram positivos y las A3 y A4 bacilos, Gram negativos. Además, todos los aislados son solubilizadores de fosfato, excepto el A5. De acuerdo con el análisis de identidad de las secuencias 16S, con un porcentaje de similitud del 99% con bacterias de referencia, las bacterias Gram positivas se identificaron como: A1, Bacillus mycoides; A2, Bacillus sp.; y A5, Paenibacillus dendritiformis. Por otro lado, las bacterias Gram negativas fueron identificadas como: A3, Achromobacter sp. y A4, Klebsiella sp. Todas estas bacterias han sido frecuentemente asociadas a las comunidades del suelo y poseen actividad promotora de crecimiento (Bulgarelli et al., 2013; Saxena et al., 2019; Wu et al., 2017; Zhang et al., 2019).
Efecto de biofertilizantes en el crecimiento vegetal. Tomando en cuenta los aislados identificados, los tratamientos consistieron en la mezcla de suelo y abono inoculados con B. mycoides (ABm), Bacillus (AB), Achromobacter sp. (AA) y P. dendritiformis (Apd). Se observó que, durante los primeros 40 días, el crecimiento de las plantas fue lento y se mantuvo uniforme entre tratamientos; luego aumentó el crecimiento, acentuándose las diferencias en algunos tratamientos hasta el fin del experimento (Tabla 1). Estas diferencias están determinadas por los nutrientes puestos a disposición por las bacterias aplicadas, ya que poseen la capacidad de fijar nitrógeno y potencialmente podrían solubilizar otros nutrientes (Bulgarelli et al., 2013; Saxena et al., 2019). Este comportamiento también ha sido observado en otros cultivos como la papa, en los que en las primeras fases del desarrollo, desde la germinación, el crecimiento no está limitado por factores externos, predominando la división celular; luego hay mayor influencia de las disponibilidad de nutrientes y se da un aumento de la longitud, volumen y peso (Gregorczyk, 1998).
Al final del experimento se observó que, según las variables evaluadas, el tratamiento con menor crecimiento y desarrollo fue el control SS (Tabla 1). Con relación a la longitud del vástago y la raíz, el análisis de la varianza [ANOVA] reveló con un nivel de significancia α = 0,01, significando que existen diferencias entre los tratamientos. Además, según la prueba de Tukey (α = 0,05), existen diferencias significativas entre el suelo solo y el resto de los tratamientos (Figura 1). Los tratamientos con mayor crecimiento son aquellos a los que se les adicionó los inoculantes biológicos B. mycoides y Achromobacter sp. Esto mismo se observó en el peso fresco del vástago (Tabla 1), con diferencias significativas con respecto al abono solo y suelo solo (Tukey p≤0,05). Al medir el peso seco del vástago y de la raíz se observan mayores diferencias significativas entre tratamientos que en los pesos frescos.
Los mayores pesos secos del vástago se observaron en los tratamientos de abono con B. mycoides, Achromobacter sp. y P. dendritiformis, y para el peso de la raíz, los mayores resultaron fueron Achromobacter sp. y Bacillus sp.; en contraste, el menor peso seco de vástago y raíz fue el tratamiento en suelo solo (Figura 1b). El ANOVA revela que para estas variables los tratamientos son diferentes, y la prueba de Tukey (α = 0,05) indica que hay diferencias significativas entre el tratamiento de suelo solo y todos los demás tratamientos. Igualmente, con el mismo nivel de significancia, existen diferencias entre el abono solo y los tratamientos inoculados con Achromobacter sp., B. mycoides y P. dendritiformis.
Durante el cultivo se observó que las plantas control SS demoraron más en iniciar la floración y desarrollaron menor número de flores, seguido del abono solo. En este sentido, las plantas que primero florecieron y fructificaron fueron las inoculadas con Achromobacter sp. y B. mycoides. Además, al analizar todas las variables se observa que todos los tratamientos son diferentes del control (Figuras 2). Asimismo, según el análisis foliar, todos los tratamientos con inoculantes mostraron mayor contenido de nitrógeno que los controles (4,3 % del peso seco en tejido de plantas tratadas con Achromobacter y B. mycoides, y 3,4 % en suelo solo). Esto corresponde con la capacidad de las bacterias aplicadas para fijar N2.
Al analizar las variables para estimar el efecto de los biofertilizantes sobre el crecimiento del ají, se puede observar a los 87 días, en todos los tratamientos con inoculante y abono, que el crecimiento vegetal se vio favorecido con respecto a las plantas cultivadas en suelo de Malambo. En conclusión, la aplicación de fertilizantes orgánicos y endomicorrizas aumenta la productividad de C. annuum (Zayed et al., 2013).
Siendo así, estos abonos, que son producidos aprovechando materiales que normalmente son desechados y causan problemas fitosanitarios, pueden potenciar y beneficiar los cultivos de los pequeños productores de la región Caribe al incrementar la productividad y sanidad del cultivo de ají.
Existe mayor efecto benéfico de los tratamientos con ABm sobre el cultivo de ají (Figura 1y 2). El género Bacillus es ampliamente empleado como herramienta biotecnológica en la agricultura y la industria y, en el caso de B. mycoides, se ha demostrado su efecto benéfico, principalmente como promotor de crecimiento y bio-controlador de fitopatógenos en tomate, pimentón, ají picante, tabaco, melón, pepino y caña de azúcar (Bai et al., 2002; Bargabus et al., 2002; Kloepper et al., 2004).
Asimismo, se ha mostrado la capacidad de especies de Bacillus de promover el crecimiento e inducir resistencia sistémica contra Botrytis cinerea y Fusarium solani en pimentón (Márquez et al., 2020), y B. subtilis incrementa el crecimiento de plantas de tomate y ají en 16 % y 37 %, respectivamente (Luna-Martínez et al. 2013), e inhibe el crecimiento del moho gris en tomates en condiciones de invernadero (Xiao-Ying et al., 2015). En este sentido, vale la pena resaltar que aunque el crecimiento de las plantas inoculadas con Bacillus sp. fue menor que en presencia de B. mycoides, las primeras se desarrollaron sin presentar signos asociados a presencia de fitopatógenos, por lo cual es necesario evaluar las posibles relaciones antagonistas del inóculo (Berg, 2009; Kloepper et al., 2004; Márquez et al., 2020).
De igual forma, se ha observado que Achromobacter sp., en cultivos de tomate, aumenta significativamente el crecimiento, parámetros de rendimiento y contenido de fitohormonas endógenas (Abdel-Rahman et al., 2017). También este género, en presencia de B. cereus, B. subtilis y Serratia sp., se ha asociado a un aumento en la disponibilidad de nitrógeno, fósforo y potasio; así como al control de fitopatógenos en cultivos de C. annuum (Zhang et al., 2019). Además, A. spanius y A. xylosoxidansse han sido reportadas como solubilizadoras de fosfato y productoras de compuestos indólicos (Gaviria-Giraldo et al., 2018) y proporcionan tolerancia a diferentes ambientes de estrés abiótico, como sequía y salinidad en plantas de tomate y ají (Shrivastava & Kumar, 2015).
Por su parte, P. dendritiformis ya ha sido estudiado y probado como bio-controlador y promotor de crecimiento. En cultivos de papa redujo significativamente el área de afectación de tubérculos infectados por Pectobacterium carotovorum y aumentó significativamente el rendimiento (Lapidot et al., 2015). Paenibacillus sp., a su vez, mostró favorecer la absorción de nutrientes de arroz cultivado en condiciones de exceso de hierro, indicando que permite mitigar dichos efectos (De Souza et al. 2015).
Dado que el nitrógeno es esencial, la fijación de N2 por parte de las bacterias tiene un efecto positivo en el metabolismo y crecimiento de las plantas (Liu et al., 2019). Sin embargo, el rendimiento de los cultivos tratados con biofertilizantes está condicionado por la adaptabilidad de los microorganismos al microclima y al suelo no nativo, ya que son aislados de regiones y condiciones diferentes para su uso (Malusà et al., 2016; Sruthilaxmi & Babu, 2017). Por lo tanto, un aspecto significativo de este trabajo es que las cepas evaluadas están adaptadas a las condiciones biológicas y ambientales de la región Caribe. Ya numerosos trabajos han demostrado la interacción benéfica de estas especies en otras regiones (Jiménez et al., 2011; Moreno-Quevedo et al., 2014; Gamez et al., 2015), empero, nunca se habían realizado en la región Caribe y en esta no existen empresas productoras de biofertilizante (Pérez-Lavalle et al., 2016; Instituto Colombiano Agropecuario [ICA], 2019).
Así, los inoculantes probados en este estudio tienen gran potencial para emplearse en el desarrollo biotecnológico adecuado para la región Caribe colombiana. Su implementación favorecería el crecimiento y producción de los cultivos tradicionales y traería otros beneficios derivados, como el reciclaje de nutrientes y recuperación de los suelos; la limpieza de los cultivos que contribuye con el control de plagas y patógenos; la disminución del uso de agroquímicos; la autosostenibilidad y la disminución de la inversión económica en el cultivo.
4. CONCLUSIONES
Eneste estudio se ha proporcionado una prospección inicial de la comunidadbacteriana presente en suelos del Caribe colombiano. Se han identificadobacterias promotoras de crecimiento, adaptadas a las condiciones ambientales dela región, que favorecen el desarrollo del cultivo de ají. Finalmente, basadosen los resultados de la prueba de campo y sustentados estadísticamente, losmejores inoculantes probados son Bacillus mycoides y Achromobacter sp. Así, dado sugran potencial como promotores de crecimiento y bio-controladores, resultaimportante realizar algunos estudios metabólicos, moleculares, pruebas deantagonismo y actividad en consorcio de estos aislados, para garantizar sufuncionalidad e inocuidad para aplicaciones biotecnológicas en la agriculturadel Caribe colombiano.
Resumen
Main Text
1. INTRODUCCIÓN
2. MATERIALES Y MÉTODOS
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4. CONCLUSIONES