Área Agrícola

Vol 12 Número 1 del 2021
DOI: https://doi.org/10.22490/21456453.3755

ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE COMPUESTOS FENÓLICOS DE TARA (Caesalpinia spinosa) FRENTE A Fusarium graminearum

ANTIFUNGAL ACTIVITY OF TARA (Caesalpinia spinosa) PHENOLIC COMPOUNDS AGAINST Fusarium graminearum

1 Mateo David León Durán, 2 Myriam Ximena Mancheno Cárdenas

1Magister en Ciencias - Biotecnología, Universidad Nacional, Medellín, Colombia.
2Magister en Sistemas Integrados en Gestión de la Calidad, Ambiente y Seguridad, Universidad Politécnica Salesiana, Cuenca, Ecuador.

1matleon@unal.edu.co, 2mmancheno@ups.edu.ec

Recibido:19/05/2020
Aceptado: 01/07/2020

RESUMEN

Contextualización: Fusarium graminearum es un microorganismo de campo que afecta a gramíneas y causa grandes pérdidas, particularmente a cultivos de arroz. Para contrarrestar estos problemas fitosanitarios se aplican cantidades excesivas de plaguicidas, lo que causa daños a la salud y el ambiente. Una alternativa son los extractos vegetales con alto contenido de compuestos bioactivos.

Vacío de conocimiento: los taninos tipo pirogalol contenidos en las vainas de Caesalpinia spinosa poseen propiedades biológicas, la inhibición del crecimiento micelial de Fusarium graminearum es efectiva en concentraciones bajas de UFC/ml.

Propósito del estudio: el objetivo de esta investigación fue determinar in vitro la actividad antifúngica de los compuestos fenólicos de la tara (Caesalpinia spinosa) frente a Fusarium graminearum.

Metodología: en primer lugar, se extrajeron los compuestos fenólicos por maceración y calentamiento (60 °C) mediante agua y una mezcla agua-etanol. Se determinó el contenido de compuestos fenólicos en los extractos mediante el método de Folin-Ciocalteu. En segundo lugar, se aisló una cepa de Fusarium obtenida de un cultivo de arroz y se identificó por claves taxonómicas; después, se realizaron suspensiones celulares con concentraciones 10⁷ y 10⁶ UFC/ml. Para la evaluación in vitro, un disco con inóculo de cada suspensión se colocó en medio cultivo agar papa dextrosa que contenía extracto de Caesalpinia spinosa.

Resultados y conclusiones: el extracto acuoso por calentamiento con un contenido de 5,88 g ácido gálico/100 g muestra seca inhibió 30 y 70% de crecimiento micelial de Fusarium graminearum a una concentración de 10⁷ y 10⁶ UFC/ml respectivamente. Compuestos fenólicos de Caesalpinia spinosa presentaron propiedades de interés para el control de Fusarium graminearum y pueden ser ensayados in vivo e invernadero.

Palabras clave: compuestos fenólicos; fitopatógeno; Fusarium graminearum; inhibición

ABSTRACT

Contextualization:Fusarium graminearum is a field microorganism that affects grasses and causes great losses, particularly to rice crops. To counter these phytosanitary problems, excessive amounts of pesticides are applied, causing damage to health and the environment. An alternative is to plant extracts with a high content of bioactive compounds.

Knowledge gap: The pyrogallol tannins contained in Caesalpinia spinosa pods have biological properties, Fusarium graminearum's micellial growth inhibition is effective at low concentrations of UFC/ml.

Purpose: Therefore, the objective in this research was to determinate in vitro the antifungal activity of tare phenolic compounds (Caesalpinia spinosa) against Fusarium graminearum.

Methodology: Firstly, the phenolic compounds extracted by maceration and heating (60 °C) through water and ethanol-water mix, the phenolic compounds content in the extracts determined by Folin-Ciocalteu method. Secondly, a Fusarium strain obtained from a rice culture isolated and identified by taxonomic keys, after cell suspensions made with concentrations 10⁷ and 10⁶ UFC/ml. For in vitro evaluation, a disc with an inoculum of each suspension placed in a culture medium containing C. spinosa extract.

Results and conclusions: Consequently, the aqueous extract by heating with a content of 5.88 g gallic acid/100 g dry sample inhibited 30 and 70% of mycelial growth of Fusarium graminearum with a concentration of 10⁷ and 10⁶ UFC/ml. Phenolic compounds of Caesalpinia spinosa have properties of interest for the control of Fusarium graminearum and can be tested in vivo, in the greenhouse.

Keywords: Fusarium graminearum; inhibition; phenolic compounds; phytopathogen

RESUMEN GRÁFICO

Resumen gráfico

Fuente: Autores.

1. INTRODUCCIÓN

Un cultivo transitorio que se ve afectado por el ataque de microorganismos en el campo es el arroz, un cereal de importancia mundial que es un alimento básico para aproximadamente 3,500 millones de personas (Muthayya et al., 2014 ). En el 2017 se produjeron aproximadamente 503 millones de toneladas métricas (t) en todo el mundo (FAO, 2018). Entre 2016 y 2017 (de abril a mayo) en Ecuador, la producción de arroz fue de 660 mil t; 90 mil t menos que durante el periodo 2015 – 2016. Esta diferencia ocurrió a causa del fenómeno del Niño y el ataque de plagas y enfermedades (Beillard & Vega, 2016). Se ha demostrado la presencia de Bipolaris oryzae, Fusarium sp., Phoma sp., Phyllosticta sp.,agentes causales de enfermedades en el grano que disminuyen la producción de arroz (Solis, 2016).

Por su parte, especies del género Fusarium se consideran principalmente como hongos de campo (Villa et al., 2014); son de particular estudio porque pueden causar hasta el 90% de pérdidas en la cosecha (Briones, 2014) en monocultivos, como es el caso del arroz, y afectan la envoltura ocasionando la pudrición de la misma (Villanueva et al., 2013; Bigirimana et al., 2015). Los síntomas de Fusarium graminearum en etapa de floración del arroz son manchas de color café claro en las glumas; posteriormente, evolucionan a lesiones marrones de tamaño y formas irregulares; en la etapa de llenado, las glumas son de color purpura; y para la cosecha, los granos maduros tienen color marrón oscuro (Tabarelli et al., 2019). Actualmente, el control de microorganismos fitopatógenos se realiza mediante técnicas de agricultura convencional (De León et al., 2013), con efectos negativos para la salud humana y daños al medio ambiente. Nuevas investigaciones plantean el uso de plaguicidas botánicos que reemplacen gradualmente a determinados plaguicidas químicos (Nava et al., 2012).

Por consiguiente, los plaguicidas botánicos no generan resistencia y no se bioacumulan en el medio ambiente; son metabolitos secundarios (fitoquímicos) extraídos de diferentes fuentes vegetales (Laxmishree & Nandita, 2017). Los compuestos bioactivos se componen de alcaloides, taninos, fenoles, flavonoides, terpenos, entre otros (De León et al., 2013). Los compuestos fenólicos tienen varios propósitos en las plantas pero destacan la pigmentación y resistencia a patógenos (Schöneberg et al., 2018).

Por lo tanto, extractos como etanólicos de Glycyrrhiza glabra y Myroxylon balsamum exhibieron actividad antifúngica frente a Fusarium guttiforme (Cerqueira et al., 2015). Extractos de acetato de etilo y metanólicos de Adenophyllum aurantium y Alloispermum integrifolium reducen el crecimiento micelial y esporulación de Fusarium solani y Alternaria alternata (De León et al., 2014). Extractos etanólicos de Phlomis fruticosa poseen actividad inhibitoria contra Aspergillus niger, Fusarium tricintum, Trichoderma viride (Soković et al., 2013).

En particular, la tara (Caesalpinia spinosa), un arbusto de tipo leguminosa originario del Perú que predomina en zonas secas y valles interandinos de Suramérica (He et al., 2016), se aprovecha en la industria química (taninos), alimenticia (aditivo hidrocoloide) y farmacéutica (ácido gálico, antioxidante) (Melo et al., 2013). Los taninos de C. spinosa son usados en medicina tradicional por sus propiedades antiinflamatorios, antimicóticos, antibacterianos, antisépticos, antitumorales y antioxidantes (Murga et al., 2016); su contenido de taninos está en un rango de 0,2 a 25% del total de masa seca, dependiendo de la especie vegetal, tiempo de cosecha, hábitat y método de extracción (Cuong et al., 2020).

El objetivo de este estudio fue determinar in vitro la actividad antifúngica de los compuestos fenólicos de tara (Caesalpinia spinosa) frente a Fusarium graminearum.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Muestra vegetal y extractos crudos

Se recolectaron vainas completamente maduras de Caesalpinia spinosa mediante el método convencional en el municipio de Guachapala, perteneciente a la provincia del Azuay, durante el mes de abril del 2017; se seleccionaron cinco árboles al azar y, en total, se colectaron 5 kg de muestra.

El material vegetal fue secado a temperatura ambiente durante cinco días; posteriormente, se separaron las semillas de la vaina. En este caso, las semillas no se tuvieron en cuenta. Para la obtención de la harina de C. spinosa se realizó una molienda fina de las vainas en una licuadora industrial Blender C86, luego se tamizó en un tamiz Advantech Nro. 18 para una granulometría de 1 mm (Aguilar et al., 2012).

En un frasco de vidrio se colocaron 0,4 g de harina de C. spinosa con 70 ml de agua destilada; después, se dejó en reposo y oscuridad durante 72 h a temperatura ambiente; posteriormente, se filtró y se llevó el extracto a un balón de aforo de 100 ml (Rodríguez et al., 2012).

En un vaso de precipitación se colocaron 0,4 g de harina de C. spinosa con 70 ml de agua destilada, la mezcla se calentó a 60 °C por 10 min, luego se filtró y el extracto se llevó a un balón de aforo de 100 ml (Játiva, 2011).

En un frasco de vidrio se colocaron 0,4 g de harina de C. spinosa con 70 ml de una solución etanólica 30%; luego, se dejó en reposo por 72 h a temperatura ambiente; posteriormente se filtró y el extracto se llevó a un balón de aforo de 100 ml (Rodríguez et al., 2012).

2.2. Identificación y cuantificación de compuestos fenólicos (CF)

En un tubo de ensayo se colocó 1 ml de cada extracto; particularmente, para el extracto acuoso se adicionó una pequeña cantidad de acetato de sodio. Después, se dosificaron a cada muestra 3 gotas de cloruro férrico 5%, la prueba es positiva cuando desarrollan una coloración azul oscura (Delporte, 2010).

Previamente, se disolvió el extracto en una proporción 1:10; en un frasco ámbar, se colocaron 50 μl de muestra, 3950 μl de agua destilada, 250 μl de reactivo de Folin – Ciocalteu; luego de 2 min, se adicionaron 750 μl de carbonato de sodio 20% (v/v); posteriormente se dejaron reposar por 1 h y se midieron a 750 nm la absorbancia.

La curva de calibración se realizó empleando ácido gálico, como estándar, a concentraciones de 200, 150, 100 y 50 ppm. La ecuación de la curva de calibración corresponde a Y = 0,007077 * X + 0,003519, R² = 0,9998. Las muestras se analizaron usando el espectrofotómetro UV – vis Jasco V – 630, los resultados se expresaron en gramos de ácido gálico/100 g muestra seca (g AG/100 g MS) (Flor & Parra, 2017).

2.3. Aislamiento, identificación y conteo celular

Fusarium se aisló de un cultivo de arroz del municipio Arenillas de la provincia el Oro en Ecuador, para la recolección del material biológico se consideraron plantas con fusariosis en la espiga, el diseño de muestreo fue en forma de X que consiste en tomar muestras de cada esquina y del centro de la parcela, por cada punto se seleccionaron al azar 20 plantas, en total se tomó 1 kg de muestra; granos infectados se sumergieron en etanol 70% e hipoclorito de sodio 1% cada uno por 2 min; posteriormente se colocaron en medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) con 50 ppm de gentamicina, en total 10 cajas Petri se incubaron a 26,5 °C por 7 d (Arbito, 2017).

La identificación del hongo se realizó mediante claves taxonómicas establecidas por (Leslie & Summerell, 2006) se analizaron características macroscópicas del micelio: color, aspecto y pigmentación del agar, y características microscópicas como: macroconidias, microconidias y clamidiosporas.

Después del lavado de esporas se preparó una suspensión celular de Fusarium graminearum en agua destilada (el cultivo debía estar en el día 7), y luego se realizó una dilución 1:10 y se colocó una muestra en la cámara de Neubauer. Con la ayuda del microscopio de pantalla Micros Austria se realizó por triplicado el conteo de conidios (Lage et al., 2013).

2.4. Evaluación in vitro

En medios de cultivo PDA previo a su gelificación se adicionó 5 ml de EAC, luego se implantó un disco con la concentración total de células y/o la dilución 1:10. El control fue inóculo de Fusarium graminearum en un medio PDA sin extracto. Las cajas se mantuvieron a 26,5 °C por 7 d en una estufa Mermmet, cada ensayo se realizó por triplicado.

La capacidad inhibitoria se determinó por la superficie de crecimiento del micelio en cm²: ((Área control – Área tratamiento)/(Área control)). Para obtener los valores correspondientes se consideró el diámetro promedio debido a que el crecimiento de los hongos es radial pero no uniforme (Schöneberg et al., 2018).

2.5. Análisis estadístico

Todos los datos obtenidos se analizaron con el software estadístico libre R versión 3.5.2. Los resultados del contenido de compuestos fenólicos en los extractos y la influencia sobre el crecimiento micelial radial se presentaron como medias ± desviación estándar. Diferencias entre tratamientos tanto para los extractos como para la inhibición in vitro se evaluaron con el modelo ANOVA de una vía (aov{stats}), con un nivel de significancia de 0,05. Los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas se evaluaron con la prueba de Shapiro-Wilk (shapiro.test{stats}) y prueba de Levene (leveneTest{car}), respectivamente. Se realizaron comparaciones múltiples por parejas por la prueba de diferencia significativa honesta de Tukey (HSD.test{agricolae}) y los resultados se expresaron como intervalos de confianza al 95%.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Compuestos fenólicos en extractos

Los extractos acuosos e hidroalcohólico presentaron diferentes coloraciones de amarillo leve a amarillo - café, esto se da por la presencia de compuestos tánicos; además se observaron flóculos de color blanco que se atribuyeron a gomas y resinas que posee C. spinosa; De la Cruz (2004) definió a estas gomas o hidrocoloides como biopolímeros que poseen efectos gelificantes.

Los extractos acuosos e hidroalcohólico mostraron una coloración azul oscura, igual característica obtuvieron en Caesalpinia spinosa (Cortez, 2012) y en Raputia heptaphylla (Coy et al., 2014), esta coloración  indica que, en las muestras existen taninos del tipo pirogalol. Los taninos son compuestos fenólicos solubles en agua que se dividen en hidrolizables (galotaninos y elágitaninos)  presentes en Caesalpinia sp y condensados (proantocianidinas) presentes en Acacia sp (Anttila et al., 2013; Fraga et al., 2020). De acuerdo a Skowyra (2014) el principal componente de los taninos de C. spinosa son basados en el ácido galoilquinico, del cual derivan el ácido gálico, ácido quinico y grupos galoil.

Mediante el método de Folin – Ciocalteu el contenido de CF en EAM, EAC y EHM fueron 4,77 – 5,88 – 4,76 g AG/100 g MS respectivamente (Figura 1). Diferencias entre tratamientos p = 0,0306. Según la prueba Tukey con el tratamiento EAC, se obtuvo un mayor contenido de CF. Según Markom et al., (2007) los taninos hidrolizables se extraen preferentemente con agua o mezclas agua – etanol, razón por la cual EAM y EHM presentaron contenido similar de compuestos bioactivos. Por otro lado, EAC fue superior debido a que al adicionar energía (60 °C) a la extracción se reducen la viscosidad y tensión superficial (Markom et al., 2010) permitiendo que los taninos se liberen de la matriz vegetal debido a la inestabilidad existente (Wang et al., 2019; Cuong et al., 2020). Otra propiedad de los solventes es la constante dieléctrica, agua destilada 78,5 Fm¯¹  y etanol es 24,5 Fm¯¹; según (Cortez, 2012) un solvente con mayor constante dieléctrica extrae mayor contenido de metabolitos secundarios.

Figura uno

Figura 1. Los resultados del contenido de compuestos fenólicos (CF) en C. spinosa se expresan como el promedio de g AG/100 g MS ± DS. Comparación de CF se realizó entre los diferentes tratamientos: extracto acuoso por maceración (EAM), extracto acuoso por calentamiento 60 °C (EAC) y extracto hidroalcohólico por maceración 30% (EHM). Tratamientos con una letra común no difieren en un nivel del 5%, según la prueba DSH de Tukey. Fuente: Autores.

En C. spinosa Kardel et al., (2013) de determinaron por colorimetría taninos condensados 4,6 mg/g en extractos butanol-ácido clorhídrico; sin embargo, en extractos por agua caliente analizados en HPLC-MS la concentración de taninos hidrolizables fue 647 mg/g de equivalentes de epigalocatequina galato; Játiva (2011) y Cortez (2012) con extractos acuosos obtuvieron 42 y 23 g AG/100 g MS respectivamente. Cabe mencionar que las muestras fueron tomadas de árboles que se encontraban en Ecuador. Por otro lado, Avilés et al., (2010) obtuvieron en extractos acuosos e hidroalcohólicos 11 y 15 g AG/100 g MS respectivamente, las muestras fueron extraídas de árboles que se encontraban en Perú. Los resultados del contenido de CF difieren a lo reportado en la literatura, por factores externos los cuales condicionan a la especie vegetal; según Nuñez et al., (2017) las características del suelo y las condiciones climáticas influyen en la acumulación de compuestos fenólicos; de acuerdo a Nieto & Barahona (2006) los requerimientos para C. spinosa son: suelos franco arenosos, temperatura 13 a 22 °C, humedad relativa < 80% y precipitaciones < 750 mm. Una posible causa para el bajo contenido de CF son las condiciones del suelo, debido a que los árboles seleccionados en el muestreo se encontraban en una zona con abundante materia orgánica.

3.2. Identificación y conteo celular de Fusarium

Las claves taxonómicas determinaron que el hongo aislado fue Fusarium graminearum, y sus características macroscópicas fueron: micelio bien desarrollado de aspecto lanudo algodonoso y de crecimiento rápido; las colonias inicialmente fueron de color blanco, transcurridos los días se tornaron de color crema; en el reverso de la caja Petri el color fue pardo; además, ciertos cultivos presentaron pigmentos rojos en el agar. Por otro lado, las características microscópicas fueron: macroconidia delgada, paredes gruesas, ligeramente curvada, septos entre 4 y 6, célula basal en forma de pie y célula apical cónica, en esta especie hay ausencia de microconidias  y clamidiosporas (Figura 2) (Melgarejo et al., 2010; Refai et al., 2015). Pacin et al., (2002) determinaron la presencia de F. graminearum en cultivos de arroz en la región costera de Ecuador.

Figura dos

Figura 2. A: Fusarium graminearum con micelio lanudo algodonoso, colonia de color crema; B: Macroconidia: curva típica septada, célula basal en forma de pie y célula apical cónica. Lente de inmersión 100x. Fuente: Autores.

A través del conteo de células por cámara de Neubauer se obtuvo una concentración aproximada a 10⁷ UFC/ml; por ende, la dilución 1:10 tiene una concentración cercana a 10⁶ UFC/ml. Con cultivos de F. oxysporum y F. solani el día nueve (Lage et al., 2013) obtuvieron concentraciones 1,8 y 2,8 10⁶ UFC/ml, esto demostró la alta capacidad de esporulación de F. graminearum.

3.3. Actividad in vitro del extracto

La actividad inhibitoria del EAC frente a Fusarium graminearum en concentración total - 10⁷ UFC/ml (CT) y concentración diluida - 10⁶ UFC/ml (CD) se expresaron como la superficie de crecimiento del micelio (cm²), control 26,44; (CT+EAC) 18,38 y (CD+EAC) 7,89 (Figura 3). Para una mejor comprensión los valores, se convirtieron en porcentaje de inhibición, control no presentó; (CT+EAC) 30,6% y (CD+EAC) 70,3%. Diferencias entre tratamientos p = 6,18 e¯⁵). De acuerdo con la prueba Tukey con el tratamiento (CD+EAC) se obtuvieron mayores porcentajes de inhibición frente al fitopatógeno (Figura 4).

figura 3-1

Figura 3-2

Figura 3. Crecimiento micelial de Fusarium graminearum. A: Control, B: 10⁷ UFC/ml con extracto acuoso por calentamiento (EAC) luego de 7 d a 26,5 °C. Fuente: Autores.

figura 4

Figura 4. Los resultados se expresan como el promedio de la superficie de crecimiento micelial en cm² de Fusarium graminearum ± DS. Control, 10⁷ UFC/ml células más extracto acuoso por calentamiento 60 °C (CT+EAC), 10⁶ UFC/ml más extracto acuoso por calentamiento 60 °C (CD+EAC), luego de 7 d a 26,5 °C. Tratamientos con una letra común no difieren en un nivel del 5%, según la prueba DSH de Tukey. Fuente: Autores.

En Fusarium sp Veloz et al., (2012) con extractos tánicos de Caesalpinia cacalaco al 1%, se obtuvo una inhibición del 68%; en Penicillium sp Játiva (2011) con extractos tánicos de C. spinosa a 2500 y 5000 ppm consiguieron 53 y 87% de inhibición respectivamente, las mismas concentraciones fueron aplicadas a Aspergillus niger y no existió inhibición. Extractos polifenólicos de Acacia farnesiana obtuvieron 98% de inhibición micelial en Fusarium oxysporum Rodríguez et al., (2012).

En esta investigación se determinó que EAC de C. spinosa frente a 10⁶ UFC/ml de Fusarium graminearum inhibió 70% de su desarrollo micelial, esto fue posible debido a que el extracto contenía taninos hidrolizables. Al comparar este resultado con otros autores, se puede asumir que extractos de especies pertenecientes a la familia Fabaceae tienen alta capacidad reducir el crecimiento in vitro de hongos filamentosos.

Extractos crudos de Khaya ivorensis y Tetracera potatoria Adekunle et al., (2003); Asphodelus tenuifolius y Euphorbia guyoniana Salhi et al., (2017); Rhus muelleri Jasso de Rodríguez et al., (2015); Parthenium hysterophorus, Acacia farnesiana y Pluchea carlinensis Rodríguez et al., (2000); Diospyros cuneata Ruiz et al., (2016), contienen compuestos fenólicos, terpénicos y alcaloides con actividad inhibitoria de 60 a 87% o capacidad fungicida frente a hongos filamentos como F. graminearum , F. oxysporum, F. sporotrichioides, A. niger, T. viride. En las investigaciones citadas la presencia de compuestos fenólicos junto a otros metabolitos secundarios alcanzaron altos porcentajes de capacidad inhibitoria, lo que demuestra  gran potencial para controlar determinados fitopatógenos.

CONCLUSIONES

Los compuestos fenólicos obtenidos del extracto crudo de vainas de C. spinosa demostraron tener actividad inhibitoria ante el crecimiento micelial de F. graminearum a nivel in vitro. EAC tuvo un contenido de 5,88 g de AG/100 g MS y la presencia de taninos tipo pirogalotánicos; mediante revisión de literatura se establecieron que las muestras son ricas en taninos hidrolizables. Respecto a la actividad antifúngica, se obtuvieron 30 y 70% de inhibición frente a concentraciones de inóculo 10⁷ UFC/ml y 10⁶ UFC/ml respectivamente. Los resultados dan viabilidad a la realización de estudios in vivo en invernaderos, controlando ciertas variables y evaluando el uso de este extracto en un sistema de manejo integrado de plagas.

Agradecimientos
Esta investigación fue desarrollada en los Laboratorios Ciencias de la Vida de la Universidad Politécnica Salesiana sede Cuenca, se agradece a los docentes del Grupo de Investigación y Valoración de la Biodiversidad (GIVABI).

Contribución de la autoría
Primer autor: metodología, investigación, análisis de datos, conceptualización, escritura – borrador original. Segundo autor: logística, supervisión y revisión.

Literatura citada