VIABILIDAD DE SEMILLAS DE GLYCINE MAX (L.) UTILIZANDO LA PRUEBA DE TETRAZOLIO

VIABILITY OF Glycine max (L.) SEEDS USING TETRAZOLIO TEST

Seir Antonio Salazar Mercado¹
Edinson Alexander Botello Delgado²

¹BiólogoMSc, docente de la Facultad de Ciencias Agrarias y del Medio Ambiente. Universidad Francisco de Paula Santander. Avenida Gran Colombia No. 12E-96B Colsag. San José de Cúcuta, Colombia.
Autor para correspondencia: salazar663@hotmail.com

²Estudiante de Ingeniería Agronómica, Facultad de Ciencias Agrarias y del Medio Ambiente. Universidad Francisco de Paula Santander.

RESUMEN: La soya (Glycine max L.) es una especie de la familia fabaceae, de gran importancia por su alto contenido de aceites y proteínas en su semilla. El éxito de la producción de este cultivo se ve mediado por factores como la utilización de simientes de alta calidad para su siembra. Por tal razón, la finalidad de este estudio fue evaluar el test de tetrazolio como método para determinar la viabilidad de las semillas de G. max. Inicialmente, las semillas fueron colectadas en el municipio El Espinal-Tolima, Colombia; las cuales se expusieron a dos concentraciones (0,5 y 1,0 %) y dos tiempos de exposición (24 y 48 horas). Posteriormente, fueron estudiadas en el estereoscopio para determinar su viabilidad, tomando como parámetro la intensidad de la coloración roja en el embrión. Se obtuvieron los mayores porcentajes de viabilidad, con los tratamientos T2 (0,5 %, 48 h) y T3 (1,0%, 24h), siendo estos estadísticamente homogéneos entre sí (p ≤ 0,05: Tukey HSD) con 97 y 95 % de semillas viables. En la prueba de germinación se registró un promedio de 96 % para las cinco repeticiones y al comparar ambos ensayos los tratamientos T2 y T3 no presentaron diferencias significativas. Concluyendo así que el test de viabilidad es efectivo a concentraciones de 0,5% y 1,0 % de tetrazolio, durante los tiempos de exposición de 48 y 24 horas.
Palabras clave: Cloruro de trifeniltetrazolio, simientes, germinación, soya.

ABSTRACT: Soybean (Glycine max L.) is a specie of the fabaceae family, of great importance for its high content of oils and proteins in its seed. The success of the production of this crop is mediated by factors such as the use of high quality seeds for planting. For this reason,
the purpose of this study was to evaluate the tetrazolium test as a method to determine the viability of G. max seeds. Initially, the seeds were collected in the municipality of El Espinal-Tolima, Colombia; which were exposed to two concentrations (0.5 and 1.0%) and two exposure times (24 and 48 hours). Subsequently, they were studied in the stereoscope to determine its viability, taking as parameter the intensity of red coloration in the embryo. The highest percentages of viability were obtained, with the treatments T2 (0.5%, 48 h) and T3 (1.0%, 24 h), these being statistically homogeneous with each other (p ≤ 0.05: Tukey HSD) with 97 and 95% viable seeds. In the germination test, an average of 96% was recorded for the five repetitions, and when both trials were compared, the T2 and T3 treatments did not show significant differences. Concluding that the viability test is effective at concentrations of 0.5% and 1.0% tetrazolium, during exposure times of 48 and 24 hours.
Key words: Triphenyltetrazolium chloride, seeds, germination, soybean.

Resumen gráfico:

Introducción

La soya (Glycine max L.) es uno de los cultivos de leguminosa más cultivados en el mundo en climas tropicales, subtropicales y templados (Salem et al., 2018). Se considera la principal oleaginosa, debido a su alto contenido en proteínas (38-40%) y aceites (18-21%) para la alimentación humana y animal (Maqueira et al., 2016), ofreciendo una fuente de proteína económica y de buena calidad (Romero et al., 2013). Además, contiene gran cantidad de ácidos grasos insaturados y aminoácidos esenciales (Valencia et al., 2010). La soja no solo posee un gran contenido nutricional, sino que es un producto de alto valor biológico que ha ganado reconocimiento por sus beneficios en la salud (Vanegas et al., 2009), debido a que contienen una serie de compuestos polifenolicos, llamados isoflavonas en forma de β-glucósidos o agliconas; sustancias que al parecer combaten el cáncer (Lopes et al., 2012). Igualmente, brinda una serie de coproductos asociados a su producción, como la glicerina, lecitina, ácidos carboxílicos y sus derivados. Asimismo, es la principal materia prima para la producción de biocombustibles (Batista et al., 2018).

La semilla es el principal órgano de propagación de la mayoría de las plantas superiores (Doria, 2010), y sin importar su empleo; sea que se siembren para la producción de cultivos o se almacenen en bancos de germoplasma; la información sobre su viabilidad (Al-Turki y Baskin, 2017) y la calidad fisiológica de las semillas, juegan un papel de gran importancia (Arenas et al., 2015).

La productividad de un cultivo depende principalmente de la calidad de las semillas obtenidas por el agricultor (Carvalho et al., 2013). Considerando la importancia de esta variable se han desarrollado pruebas como el test de tetrazolio, que es uno de los principales métodos de evaluación de viabilidad de la semilla, a causa de las múltiples ventajas que ofrece sobre las pruebas estándar de germinación; ya como método que el ensayo se centra en el físico y el estado fisiológico del embrión de la semilla. Los costos son bajos y el test se lleva a cabo en poco tiempo y en ocasiones es posible concluir por que la semilla ha perdido su viabilidad (Ribeiro et al., 2010). Aunque, se debe tener en cuenta la germinación como aspecto de vital importancia para el mantenimiento de una especie; siendo este influenciado por una serie de factores internos y externos (Bolaños et al., 2015), como la temperatura de germinación, que es característico de cada especie (Martinez et al., 2012). La prueba de tetrazolio se basa en la actividad de las enzimas deshidrogenasas (Faber et al., 2015), especialmente la deshidrogenasa del ácido malico, que reduce la sal del tetrazolio en los tejidos vivos de la semilla, formando trifenil-formazan (compuesto de color rojo), lo que indica la actividad respiratoria en la mitocondria y que el embrión de la semilla está vivo. Por el contrario, en los tejidos muertos no se lleva a cabo esta reacción. En consecuencia, no se presenta una coloración característica. (Gutiérrez et al., 2011; Medeiros et al., 2015).

Para que los resultados de la prueba sean propicios, la absorción del tetrazolio debe ser adecuada; por lo tanto, las semillas deben ser pre-embebidas en agua, antes de sumergirse en la solución de tetrazolio, para activar el metabolismo enzimático; después de este pre-acondicionamiento, muchas especies necesitan técnicas preparatorias como la punción o remoción del tegumento (Jacome y dos Santos, 2010). la presente investigación evalúa el test de tetrazolio como método para determinar la viabilidad de las semillas de G. max.

Materiales y métodos

Material vegetal

Para llevar a cabo esta investigación, se utilizaron semillas de soya seleccionadas al azar de cultivos establecidos en el municipio El Espinal-Tolima, Colombia, en septiembre del 2017. Durante el estudio los simientes fueron almacenados en sobres de papel Kraft, en un ambiente controlado, a 28 ± 2 °C y humedad relativa del 60%, con el fin de evitar su deterioro. La evaluación se realizó en el laboratorio de Fisiología Vegetal, ubicado en la Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente, en la Universidad Francisco de Paula Santander.

Viabilidad de semillas.

Inicialmente con el objetivo de exponer el embrión a la acción directa del tetrazolio, se realizó una incisión longitudinal de la testa (Faber et al., 2015), utilizando una cuchilla de acero inoxidable, y unas pinzas para sostener la semilla, durante el corte (Figura 1).

Figura 1. Procesamiento de las semillas de Glycine max para la evaluación de la viabilidad. (A) Corte longitudinal de la semilla. (B) Vista frontal de la semilla. (C) Semilla sin testa. (D). Morfología interna de la semilla después de la incisión longitudinal en la testa. c: endospermo, h: hilo, o: eje embrionario, hi: hipocotílo, r: radícula, p: plúmula. (Fuente: elaboración propia).

Posteriormente para la determinación de viabilidad por el método de tinción, se utilizaron 100 simientes, los cuales se sumergieron en una solución de 2, 3, 5-cloruro trifenil tetrazolio (tetrazolio), a distintas concentraciones (0,5 y 1%) y tiempos de exposición (24 y 48 horas) en ausencia de luz, a una temperatura de 25 °C (Tabla 1). Transcurrido el tiempo de inmersión, las semillas se separaron de la solución usando un pequeño colador,  y se llevaron a un previo lavado con agua destilada para remover el exceso del colorante (Espitia et al, 2017); seguidamente se examinaron, con la ayuda de un microscopio estereoscopio LEICA EZ4, para clasificar que tan viables eran las semillas, tomando como parámetro de selección la intensidad de la coloración roja presente en el embrión (International Seed Testing Association, 2010); que se formó por la reducción del tetrazolio debido a la actividad respiratoria de las células (Salazar, 2012; Salazar y Cancino, 2012). Por lo contrario, la ausencia de la coloración roja indicaba una menor viabilidad o muerte del embrión.

Tabla 1. Tratamientos de Glycine max con diferentes concentraciones y tiempos de exposición con Tetrazolio.

(Fuente: elaboración propia)

 Germinación

La prueba de germinación fisiológica se realizó con el propósito de calcular la confiabilidad del test de tetrazolio, al comparar los resultados de ambos ensayos (Iossi et al., 2016). Esta se llevó a cabo al utilizar el método germinativo en toallas de papel húmedas, en un recipiente plástico previamente desinfectado, bajo condiciones de oscuridad, durante 72 horas. Se evaluaron 100 semillas y 5 repeticiones de la muestra representativa. Los resultados se expresaron como porcentaje de germinación, al realizar el conteo de los granos germinados.

la prueba de tetrazolio y germinación pueden presentar diferencias, debido a que el test de tretazolio no permite identificar las infecciones causados por hongos, fitotoxicidad y anomalías en las plántulas ya que, es una prueba bioquímica que diferencia los tejidos vivos de los muertos en los embriones de las semillas, tomando como base la actividad de las enzimas deshidrogenasas (Ruiz, 2005), lo cual puede implicar en los resultados de las pruebas, de tal forma estos no serían comparables. En este estudio, las semillas utilizadas tanto en la prueba de viabilidad y germinación fueron tomadas del mismo lote con condiciones fitosanitarias óptimas.

Diseño experimental

El diseño experimental consistió en un análisis factorial 2x2 completamente al azar (dos concentraciones de tetrazolio y dos tiempos de exposición) con 5 repeticiones y 100 semillas por repetición, para el experimento. Con la finalidad de comprobar el efecto de los tratamientos sobre el porcentaje de embriones viables detectados, se aplicó el análisis de varianza (ANOVA). Seguidamente, las medias se compararon al utilizar la prueba de rangos múltiples de HSD (Honestly Significant Difference) de Tukey, con la intención de determinar si existen diferencias significativas, con un nivel de p  0.05. El análisis estadístico se realizó al implementar el software Statgraphic Centurion® versión 17 y las gráficas se elaboraron mediante el uso del software KyploT 2.0.

 Resultados y Discusión.

Viabilidad de las semillas de Glycine max

El análisis para determinar la viabilidad de las semillas (Tabla 2), indica que los tejidos de las simientes, son influenciados de forma distinta por las concentraciones y tiempos de exposición a la sal de tetrazolio. El mayor porcentaje de viabilidad se obtuvo al implementar los tratamientos T2 (0.5, 24h) y T3 (1%, 48h), siendo estos estadísticamente homogéneos entre sí.

Tabla 2. Porcentaje de la viabilidad de semillas de Glycine max utilizando la prueba de Tretrazolio.

La prueba de tetrazolio se considera un método colorimétrico confiable (Araméndiz-Tatis et al., 2013) y oficial para determinar la viabilidad de las semillas (Salazar et al., 2013). Por la fácil detección de las semillas viables. Debido al característico color rojo, que se forma de la reducción de la sal del tetrazolio a formazan, indicando que existe respiración celular y así mismo que la semilla es viable (Salazar y Gélves, 2015). La uniformidad y distribución de la tinción se puede observar en la figura 2, donde las semillas viables (vivas) se denotan al observar la coloración roja o rosada del embrión, a causa de la reacción con la solución, indicando que hay actividad respiratoria en las mitocondrias. Por otra parte, el tejido muerto no reacciona con la solución manteniendo el color natural (Takao et al., 2017).  Además, esta tinción permite distinguir el estado exacto de los tejidos normales, indicando, si son bajo, mediana o altamente viables, todo esto en relación la intensidad de la tinción: del mismo modo, al observar el grado de coloración de las partes de la semilla, se puede determinar la presencia, la localización y la naturaleza de las alteraciones en los tejidos de esta (Prieto et al., 2011; Espitia et al., 2017).

Figura 2. Evaluación de la Viabilidad de semillas de Glycine max utilizando la prueba de
tetrazolio. (A, B, C, D, E, F) Semillas viables. (G, H) Semillas no viables. (Fuente: elaboración propia)

Germinación.

En la prueba de germinación se obtuvo un porcentaje promedio del 96 % de semillas germinadas (Tabla 3). Este valor se relaciona con los porcentajes de viabilidad de los tratamientos T2 y T3 (Tabla 2). Por lo general la prueba de germinación nos permite conocer si una semilla no germinó por ser latente o por presentar algún daño en el embrión (Elizalde et al., 2017). Debido a que, en algunos casos, aun en condiciones hídricas y térmicas óptimas, una semilla viable no germina, a causa de la dormancia (Checovich y Ruiz, 2012), siendo esta descripta como una propiedad adaptativa de las semillas (Agüero et al., 2017). Por tal razón se tienden a combinar dos o más métodos que permitan complementar la información acerca del comportamiento de las semillas con relación a su capacidad de emergencia (Salinas et al., 2001). Con respecto a lo anterior la eficacia del test de viabilidad de tetrazolio se comprobó con una prueba de germinación estándar (Prieto et al., 2011). Además, la comparación de dichos ensayos nos permite conocer el potencial de la calidad fisiológica de las semillas, que son de gran importancia en los procesos de certificación y comercialización de las simientes, y conservación del germoplasma (Espitia et al., 2016).
Tabla 3. Porcentaje de Germinación de Glycine max.

(Fuente: elaboración propia)

 Comparación de viabilidad y germinación.

La coherencia en los resultados de la prueba de viabilidad con tetrazolio y la de germinación estándar en el lote de simientes evaluados son similares, determinando así que los tratamientos más confiables para determinar la viabilidad de las semillas, son el T2 y T3, siendo estos estadísticamente homogéneos entre sí (Figura 3); teniendo en cuenta que las diferencias entre los porcentajes de los dos ensayos no superan el 5 %; siendo normales en semillas de Glicyne max (Bauer et al., 2003).

Figura 3. Comparación de los tratamientos de viabilidad y germinación de Glycine max. Las barras con diferente letra dentro de cada ensayo de viabilidad y germinación, demuestran diferencias estadísticamente significativas, de acuerdo a la prueba de de Tukey HSD (P≤0.05). Fuente: elaboración propia; Software: KyploT 2.0.

Por otro lado, los tratamientos T1 y T4 presentan diferencias significativas entre la prueba de germinación y el test realizado con tetrazolio. Estas desigualdades del 6% en el caso del tratamiento 1 y 11% en el tratamiento 4 (Figura 3), manifiestan que estos no son confiables, ya que superan los límites de diferencia entre los porcentajes de los ensayos, permitidos para la soya. Estas discrepancias pueden ocurrir porque la prueba de tetrazolio, no determina la capacidad división celular (Salazar et al., 2013), solo evalúa el embrión, y no considera la acción de las estructuras externas de las semillas en los resultados de germinación (Caravita y Takaki, 2014); otra razón a la que se le puede atribuir esta desigualdad, es que cada especie es diferente y que la calidad de la semilla cambia según los factores internos y externos (Maldonado et al., 2016). Por otro lado, Alves et al. (2006) reportó que los daños mecánicos en la semilla, ocasionados al retirar el tegumento, se reflejan en la baja intensidad de la tinción, en la región central del tejido de reserva y el eje embrionario del simiente, no permitiendo así una correcta evaluación. Considerando lo anterior, la remoción del tegumento de la semilla es necesario para obtener una penetración uniforme y reducir el tiempo de exposición al tetrazolio. Sin embargo, los resultados pueden ser alterados debido a que es un proceso delicado y laborioso que puede llevar a la eventual ocurrencia de daños al embrión (Guedes et al., 2010).

La interpretación de los resultados obtenidos, confirman la posibilidad de utilizar el test de tetrazolio para evaluar la viabilidad de las semillas de Glycine max. Siendo esta prueba empleada en diversas especies, como, Elleanthus arauntiacum, Epidendrum sp, Maxillaria sp, Odontoglossum lindenii, Prosthechea sp, Telipogon dubios, Stelis sp, Elleanthus sp, Epidendrum elongatum y Cyrtochilum sp (Salazar y Gélvez, 2015), Triticum aestivum L. (Ribeiro et al., 2010), Leucaena leucocephala (Jacome y dos Santos, 2010), donde se ha comprobado que es un método rápido y eficaz al momento de determinar la viabilidad de los simientes.

Conclusión

Se determinó que la prueba de tetrazolio es apta y ofrece una alternativa de estudio rápido de viabilidad en semillas de soya (G. max). En donde, se puede predecir el potencial germinativo del lote de simientes.  Además, el tiempo y la concentración de tetrazolio juegan un papel importante en la prueba, al utilizar tanto la concentración de 0,5 % durante 24 horas, como la concentración de 1 % en un periodo de exposición de 48 horas, muestran un alto grado de eficiencia para determinar la viabilidad de las semillas de G. max.

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Agradecimientos

A la Universidad Francisco de Paula Santander por su valiosa colaboración. A Guillermo Javier Valderrama Riaño por su apreciable colaboración con el material vegetal.