Isolamento de lectinas por cromatografia de afinidade

Aislamiento de lectinas por cromatografía de afinidad

Isolation of lectins by affinity chromatography

 José Camilo Torres Romero¹, Myriam Janeth Ortega Torres², Jhon Alexander Infante Betancour³ & Cicero Antonio Maia Cavalcante⁴

 ¹Licenciado en Biología, Magister en Ciencias – Bioquímica, Doctor en Bioquímica.²Licenciada en Biología. Magister en Producción Animal- Genética Molecular Animal. Estudiante Doctorado en Producción Animal.³Biólogo, Magister en Ciencias-Biología. ⁴Bacharel em Ciências Farmacêuticas, Licenciatura em Ciências Biológicas, Especialização em Ensino de Biologia,  Especialização em Saúde Pública, Mestrado profissional em Ensino de Ciências e Matemática., Estudante Doutorado em Biotecnologia.

 ^{1, 2}Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente –ECAPMA. Universidad Nacional Abierta y a Distancia UNAD. Bogotá. Colombia. ³YOLUKA ONG Fundación de Investigación en Biodiversidad y Conservación. ⁴Instituto Federal do Ceará – IFCE. Jaguaribe –Ceará, Brasil.

¹jose.torres@unad.edu.co, ²myriam.ortega@unad.edu.co, ³jhon.infante@yoluka.org.co, ⁴cicero.carla@uol.com.br

Resumo

Cromatografia de afinidade é uma técnica usada para separar compostos, como, por exemplo, determinadas proteínas, que têm a capacidade de se ligar não covalentemente e reversivelmente a moléculas específicas conhecidas como ligantes. Esse método difere das técnicas de cromatografia clássica devido a proteína conseguir ser separada com base em uma única propriedade bioquímica. Em cromatografia de afinidade, o ligante está ligado covalentemente à matriz, que deve ser quimicamente inerte, porosa e também ter uma variedade de grupos funcionais adequados para acoplamento com ligantes diferentes.   Várias matrizes e ligantes são usados em cromatografia de afinidade, dependendo da proteína a ser purificada. Esse trabalho descreverá alguns aspectos importantes para o isolamento de lectinas através da técnica de cromatografia de afinidade utilizando-se carboidratos.

Palavras-chave: proteínas, lectinas, carboidratos, isolectinas, cromatografia. 

Resumen

La cromatografía de afinidad es una técnica utilizada para separar compuestos de muestras complejas, tales como ciertas proteínas, que tienen la capacidad de unirse de forma reversible y no covalente con moléculas específicas conocidas como ligando. Este método difiere de las técnicas de cromatografía clásicas de proteína para realizar el aislamiento en la base de una única propiedad bioquímica. En la cromatografía de afinidad el ligando se une covalentemente a la matriz, que debe ser químicamente inerte, porosa y, además, tener una variedad de grupos funcionales adecuados para el acoplamiento con diferentes enlazadores. Varias matrices y condiciones se utilizan en cromatografía de afinidad, dependiendo de la proteína a purificar.  Este artículo de investigación describe algunos aspectos importantes para aislar lectinas por cromatografía de afinidad utilizando carbohidratos.

Palabras clave: proteínas, lectinas, carbohidratos, isolectinas, cromatografía. 

Abstract

Affinity chromatography is a technique used to separate compounds from complex samples, such as certain proteins, that have the ability to bind reversibly and non-covalently with specific molecules known as ligands. This method differs from classical protein chromatography techniques by performing isolation at the base of a single biochemical property. In affinity chromatography the ligand is covalently bound to the matrix, which must be chemically inert, porous and, furthermore, have a variety of functional groups suitable for coupling with different linkers. Several matrices and conditions are used in affinity chromatography, depending on the protein to be purified. This paper describes some important aspects for isolating lectins by affinity chromatography using carbohydrates.

Key-words: proteins, lectins, carbohydrates, isolectin, Chromatography.

Introdução

Os métodos de separação de misturas de diferentes componentes mediante a utilização de fases são conhecidos como cromatografia (Cardona & Muñoz, 2016). O início da utilização da cromatografia como método de separação data de 1903, ocorrendo o seu posterior desenvolvimento e evolução a partir de 1930. A primeira pessoa a definir o termo cromatografia foi o botânico russo Miguel Tswett (1872-1913) no ano de 1906, escolhendo esse termo das palavras gregas khromatos (cor) e graphein (escrita) para descrever a separação dos pigmentos de plantas em diferentes zonas coloridas. Atualmente, o termo cromatografía tem sido utilizado para o isolamento também de compostos incolores, permitindo o isolamento de proteínas através de sua afinidade por outras biomoléculas. Esse trabalho tem como objetivo demonstrar a importância da cromatografia de afinidade para o isolamento de lectinas. 

Características das lectinas importantes para seu isolamento

As lectinas são um grupo de proteínas que tem como característica principal a capacidade de ligar-se a carboidratos (Micucci & Camps, 1987). Elas estão presentes em todos os organismos, o que sugere que desempenham diversas funções biológicas básicas, tais como regulação, adesiva, defesa contra patógenos, dentre outras. (Varki et al., 2009). Um organismo apresenta, normalmente, um número de diferentes lectinas presentes em várias isoformas, chamadas isolectinas (Van Damme et al., 1998). As isolectinas se diferenciam na sua estrutura primária, apresentando pequenas variações nessa estrutura, e na especificidade de ligação ao carboidrato, podendo apresentar diferenças em suas atividades biológicas (Leavitt et al., 1977). Portanto, ao se isolar uma lectina também é importante pensar nas  suas  isolectinas. 

A estrutura geral das lectinas permite a sua classificação em três grandes grupos. O primeiro representado pelas Merolectinas que apresentam um único domínio de ligação de hidrato de carbono. O segundo representado pelas Hololectinas que apresentam dois ou mais domínios de ligação de hidratos de carbono. O terceiro representado pela Quimerolectina que contêm domínios adicionais não-lectinicos, geralmente catalíticos (Peumans & Van Damme, 1995). A maioria das lectinas apresentam múltiplos locais de ligação que podem ser uteis em associações de entrecruzamento com glicorreceptores específicos na superfície da célula (Geijtenbeek  & Gringhuis, 2016). Lectinas também atuam como moléculas de reconhecimento nas interações de molécula-celula (Brown, Crocker, 2016), célula-celula (Geijtenbeek & Gringhuis, 2016) e estão envolvidas em processos celulares, incluindo adesão, migração, diferenciação, proliferação e apoptose (Huang et al., 2017).  Além disso, muitas lectinas ativam respostas fisiológicas diversas em vários organismos e possuem propriedades imunomoduladoras, apresentando funções potenciais no câncer e na metástase (Perillo et al., 1998; Sharon & Lis, 1989, Wu et al., 2017), o que as torna potencialmente úteis em aplicações biotecnológicas e biomédicas.

A ligação entre as lectinas e os carboidratos caracterizam-se pelo fato de serem não covalentes e reversíveis, sendo realizadas por interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio,  interações eletrostáticas, interações de van der Waals e atração dipolo (Lehr, 2000). A ligação entre os açúcares -mono e dissacarídeos- e a lectina é relativamente fraca, com constates de dissociação expressas em micromolar ou milimolar. Por outro lado, as interações multivalentes da lectinas com complexos ramificados de hidratos de carbono resultam em ligações mais fortes com constantes de dissociação expressas em nanomolares ou mesmo picomolares (Varki et al., 2008). 

Em geral, as lectinas possuem propriedades bioquímicas e de ligação, que são muito convenientes para sua purificação por cromatografia de afinidade utilizando carboidratos. Elas não reagem cataliticamente com eles, ao menos que a lectina tenha um subdomínio glicosidase catalítico. Como observado anteriormente, as lectinas se ligam aos hidratos de carbono de forma não covalente e reversível. Os ligantes mais utilizados para o isolamento das lectinas ,  são mono e dissacarídeos, que ligados de forma relativamente fraca, a essas proteínas são prontamente libertados de uma coluna de afinidade por eluição competitiva usando hidratos de carbono específicos libres ( Moreira et al., 1997; Moreira & Perrone, 1975). Além disso, as lectinas e carboidratos são compostos geralmente estáveis, portanto eluição utilizando técnicas de condições extremas de pH e / ou força iónica podem também ser aplicados para libertar uma lectina a partir da coluna de afinidade (Vega & Perez, 2006).

Qualquer fonte de interesse pode ser selecionada para o isolamento de lectinas, de seres humanos e outros animais, a plantas, fungos, bactérias e até mesmo os vírus (Procópio et al., 2017).  Em primeiro lugar, uma lectina deve ser liberada a partir da fonte em solução, geralmente por liberação a partir das células. Vários métodos podem ser utilizados, dependendo sobre as características mecânicas do tecido de origem, como por homogeneização por ruptura mecânica ou por lise (Voet e Voet, 1995). As lectinas são proteínas solúveis em água, portanto, são extraídas com tampões aquosos e salinos. 

A extração da lectina de interesse deve ser realizada a 4 ° C para evitar a sua desnaturação e degradação por enzimas proteolíticas. A adição de inibidores de protease no tampão de extração é recomendado se a atividade proteolítica é observada no extrato (Kvennefors et al, 2008; Matsumoto et al, 2011; Watanabe et al, 2007), apesar de algumas lectinas encontradas serem bastante resistentes à degradação proteolítica (Pohleven et al., 2009). Inibidores de glicosidase, tais como o inibidor de glucosidase -desoxinojirimicina (0,2 mM) e do inibidor da manosidase -deoxymannojirimicin (0,2mM), também podem ser adicionados ao extrato para impedir a clivagem de hidratos de carbono imobilizados na coluna de afinidade (Watanabe et al., 2007). Antes do extrato ser aplicado a coluna de afinidade, algumas impurezas podem ser removidas usando precipitação fracionada com sulfato de amónio e / ou de outras técnicas cromatográficas clássicas. As frações de lectina podem ser monitoradas em todo o processo de purificação acompanhando-se a sua atividade hemoaglutinante, para isso utiliza-se de eritrócitos específicos, visto que, só as células vermelhas com glicanos lectinas específicas são aglutinados. (Cavalcante et al., 2016). 

Isolamento de Lectinas através da técnica de Cromatografía de Afinidade

Uma vez preparado o extrato que exibe atividade de hemoaglutinação, o método de cromatografia de afinidade de hidratos de carbono adequado para a purificação da lectina deve ser selecionado. Isso envolve o adsorvente que pode se ligar a lectina e separá-lo a partir do extrato, e de uma técnica de eluição que possa liberar a lectina ligada a coluna. Por conseguinte, é importante conhecer a especificidade e estabilidade da lectina e também examinar a estabilidade do adsorvente, extremos de pH e temperatura podem ser utilizados para o acoplamento do ligante com o agente de eluição (Melgarejo et al., 2005). A especificidade da lectina desejada em um extrato pode ser determinada através da análise da sua atividade de aglutinação, utilizando várias classes de eritrócitos que expõem diversos glicanos em suas superfícies. Por exemplo, no sistema ABO, o grupo sanguíneo humano A expressa a forma não redutora do carboidrato N-acetilgalactosamina, o grupo B, expressa galactose e o grupo O expressa fucosil-galactose (Schenkel-Brunner, 2007). Além disso, a inibição a aglutinação utilizando vários hidratos de carbono ou glicoproteínas, pode ser usado para determinar o especificidade da lectina, permitindo que o adsorvente lectina específica possa ser selecionado. A estabilidade da lectina pode ser avaliada examinando-se a atividade de aglutinação do extrato. No entanto, diversas observações (Moreira et al., 1997), sugerem que a lectina de um extrato é mais estável do que a isolada, provavelmente pela importancia dos acucares no contexto molecular da proteina  (Abrantes et al., 2013). 

Dependendo do ligante e do adsorvente, pode-se utilizar as técnicas de eluição competitiva ou eluição a diferentes pH e / ou força iónica para que a lectina ligada a coluna de afinidade seja liberada. Ao escolher a técnica mais apropriada para desadsorver uma lectina ligada, a especificidade, a sua estabilidade, e o tipo de adsorvente, isto é açúcar ou polissacarídeo complexo, devem ser considerados. Quando um monossacarídeo ou dissacarídeo é usado como um ligante, a lectina é facilmente liberada da coluna de afinidade por eluição competitiva, para isso devem ser utilizados hidratos de carbono específicos com maior afinidade para a lectina do que o adsorbente (Moreira & Perrone, 1975). 

A maioria dos autores relatam o uso de eluição competitiva de lectinas utilizando mono ou dissacárideo específico. Por exemplo, quando uma lectina foi isolada em Sepharose, galactose foi utilizado para a dessorção (Cao et al., 2010; DeSimone et al., 2006), enquanto que a glucose foi utilizada com Sephadex  (Rittidach et al., 2007; Sun et al., 2007). As concentrações de açúcares utilizados são geralmente de 0,2 M (variando entre 0,01 - 0,5 M), enquanto que o gradientes de açúcar também têm sido utilizados (Cammarata et al., 2007; Mansour & Abdul-Salam, 2009). Posteriormente, estas lectinas associadas a açúcares devem ser tratadas para libertar seus  sítios de ligação, geralmente por diálise (Vega & Pérez, 2006). Alternativamente, a fim de evitar o último passo, as lectinas podem ser dessorvido da coluna com alteração das condições a extremos de pH ou de força iónica (Vega & Pérez, 2006). Esta última técnica depende da estabilidade química das substâncias ligantes da matriz e adsorvida e não é adequado para lectinas e adsorventes que são destruídos em tais condições (Vega & Pérez, 2006).  Apesar dos hidratos de carbono e lectinas, geralmente, serem moléculas estáveis, é preciso ter cuidado para não danifica-los de forma irreversível (Obando, Barahona & Chamorro, 2014). As frações contendo as proteínas devem ser neutralizados imediatamente, geralmente com 2 M ou 1 M de Tris-HCl, pH 7,5 (Vega & Pérez, 2006).  A coluna também deve ser equilibrada com o tampão de ligação. Quando  oligo ou polissacarídeos  ramificados  com elevada avidez para as lectinas são utilizados como adsorventes, as lectinas não pode ser prontamente eluída utilizando açúcares monovalentes com menor afinidade para lectinas. Neste caso, devem ser utilizados pH extremo e / ou condições de força iónica. Vários autores relataram a eluição de lectinas utilizando ácidos (20-100 mM de glicina-HCl ou alanina, pH 2,5, ou 1-3% de ácido acético ácido)  (Kaur et al., 2006)  ou bases (NaOH 10 mM, trietanolamina 0,1 M, pH 11, ou Tris-OH tampão de pH 11,4 (Vega & Pérez, 2006 ), assim como soluções de tampões contendo NaCl 1 M e 3 M de MgCl2 (gradiente foi também utilizado)  (Naganuma et al., 2006). Em alguns casos, as lectinas foram eluídas utilizando 6 M (Matsumoto et al., 2011) ou 8M de Ureia (Suseelan et al., 2002). A atividade de ligação da lectina para carboidratos pode depender de íons metálicos bivalentes tal como acontece como as lectinas   tipo C (Gringhuis et al., 2007; Den Dunnen et al., 2008), que podem ser eluídas utilizando tampões contendo agentes quelantes, tais como 2-100 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (Ourth et al., 2005). 

Outros métodos para a purificação de lectinas

Além de cromatografia de afinidade com os carboidratos, outros métodos têm sido utilizados para purificar lectinas. Algumas lectinas foram purificadas utilizando precipitação fraccionada com sulfato de amónio como sal precipitante como indica Oliveira et al. (2002) e Vence et al. (2012), seguido por métodos clássicos, tais como cromatografia de troca iónica e cromatografia de filtração em gel (Horibe et al, 2010; Pan et al, 2010). As lectinas são geralmente glicoproteínas, portanto, alguns autores descrevem seu isolamento por cromatografia de afinidade a partir da utilização das lectinas na captura de outra, por exemplo, a Concanavalina A é frequentemente imobilizada para isolar outras lectinas  (Absar et al, 2005.; Charungchitrak et al, 2011; Konkumnerd et al, 2010; Petnual et al, 2010; Yan et al, 2010). Além disso, pode-se trabalhar com partículas ferromagnéticas com polissacarídeo imobilizado   preparados para o isolamento de lectinas (Porter et al., 1998). As propriedades magnéticas das partículas favorecem a lavagem das impurezas utilizando um campo magnético, e os açúcares são utilizados para libertar as lectinas e recuperar as partículas (Angeli et al., 2009; Kavunja et al., 2015). Um novo método para a purificação cromatográfica de afinidade de lectinas é a utilização de membranas com nanofibras glicosiladas, no qual, uma membrana de afinidade com glicose imobilizada mostrou forte e reversível capacidade para isolar lectinas (Che et al., 2011). 

Conclusões

Pode-se concluir que a cromatografia de afinidade com carboidratos é, o método mais amplamente utilizado para a purificação de lectinas, apresentando-se como um método simples que tira proveito de suas propriedades específicas. No entanto, não existe um protocolo de aplicação geral e a seleção da matriz de ligação mais apropriada, da técnica de eluição e da ativação da matriz podem ser difíceis, devendo ser selecionadas de acordo com cada tipo de lectina que se pretende isolar. 

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